微小核糖核酸在白塞病發病中的作用及其臨床應用前景

葉京芬(綜述) 管劍龍(審校)

(復旦大學附屬華東醫院免疫風濕科 上海 200040)

微小核糖核酸在白塞病發病中的作用及其臨床應用前景

葉京芬(綜述) 管劍龍△(審校)

(復旦大學附屬華東醫院免疫風濕科 上海 200040)

微小核糖核酸(miRNA)是核糖核酸干擾的內源性介質,通過誘導轉錄后靶基因表達沉默發揮生物學作用。miRNA對機體免疫細胞具有多種調控功能,參與固有免疫和適應性免疫的調節。異常表達的miRNA通過調節免疫細胞炎性因子參與白塞病(Behcet’s disease,BD)的發病,可能成為BD診斷的標志物和治療靶點。本文從miRNA調節自身免疫,部分miRNA參與BD發病的機制,miRNA潛在的臨床應用價值等進行綜述。

微小核糖核酸; 炎性因子; 白塞病

白塞病(Behcet’s disease,BD)是一種慢性、系統性、炎癥性疾病,其病理基礎是血管炎,可累及全身大小血管[1]。臨床上以復發性口腔潰瘍、生殖器潰瘍、葡萄膜炎和皮膚損害為特征,也可發生消化道潰瘍、心臟瓣膜病、靜脈血栓、動脈狹窄、動脈瘤、關節炎、血液和神經系統損害。發病機制尚不完全明確,已知感染等環境因素作用于具有遺傳傾向的個體,導致免疫細胞炎性因子高表達,參與BD的發病[2-3]。1990年,Napoli等[4]首次發現RNA干擾現象;隨后,Fire等[5]提出miRNA是RNA干擾的分子基礎。近年來miRNA作為新的生物學分子通過機體內復雜的網絡調控體系,參與控制生物體內一系列生物學進程,在BD發病過程中發揮重要作用。本文就BD發病相關的miRNA和miRNA在BD診斷、治療方面的潛在臨床價值進行闡述,為進一步理解BD發病、明確診斷和治療提供新視角。

miRNA概述 miRNA是長度為19～22個核苷酸組成的非編碼RNA,基因轉錄后其與mRNAs互補結合誘導靶基因降解或抑制靶基因表達而發揮生物學作用。miRNA首先通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄合成含有5’端7甲基鳥嘌呤帽子和3’端多聚核苷酸尾結構的原始miRNA (pri-miRNA),經過Dorsha和DGCR8兩個關鍵酶修飾,最終形成含有莖-環結構的pre-miRNA,隨后,pre-miRNA被Exportin5和Dicer引導進入含有Argonaute蛋白的RNA誘導復合體(RNA-induced silencing complex,RISC),結合到RISC的miRNA遵守堿基互補的原則指導RISC降解同源目標mRNA,從而使靶基因沉默[6],進一步影響蛋白質的表達,參與調節免疫細胞產生、分化和炎性因子的表達。研究表明,miRNA通過影響免疫細胞炎性因子表達參與BD發病與進展(圖1)[6-12]。

Some miRNAs may be involved in this process by regulating the expression of target mRNAs and its coded protein.Studies showed that increased levels of inflammatory cytokines including IL-1β,IL-17,INF-γ,MCP-1,IL-6 and low level of IL-10 have been linked to altered expression of miRNAs,miRNA-155,miRNA-21,miR-23b and miRNA-196a.

圖1 miRNAs通過調節炎性因子表達參與BD發病

Fig 1 miRNAs involved in the pathogenesis of BD by regulating the expression of inflammatory cytokines

miRNA參與固有免疫調節 巨噬細胞(macrophages,mφ)是固有免疫重要的組成部分,根據mφ表面分子不同分為M1型和M2型。動物實驗表明,M1、M2型mφ在BD的發病與進展中起作用,疾病活動期主要依靠M1型mφ分泌的炎性因子IFN-γ、IL-6等實現,而在恢復期BD中則表現為M2型mφ標志物Arg1和MHC-Ⅱ表達升高,調節mφ表型可能是一種新的治療BD方法[13]。眾多miRNA在mφ極化中具有調控作用。miRNA-146a可通過抑制靶基因INHBA表達抑制M1型mφ極化、促進M2型mφ極化[14]。相反,miRNA-155則通過靶向下調SOCS1表達,參與并促進mφ炎癥應答,miRNA-155過表達顯著拮抗地塞米松對TNF-α、IL-6及NO等炎性介質的抑制作用,是糖皮質激素發揮抗炎效果的作用靶點及潛在增敏劑[15]。糖皮質激素是BD常用治療藥物,進一步探索BD炎癥應答中相關miRNA的功能,調整內源性miRNA的水平,可能為糖皮質激素耐受BD患者提供新的治療思路。

miRNA參與適應性免疫調節 初始CD4+T細胞活化誘導基因表達程序變化,進一步分化為Th細胞、CTL細胞和Treg細胞,參與適應性免疫應答和免疫記憶。miRNA的核心蛋白Ago2影響T細胞中miRNA表達,下調T細胞Ago2蛋白和miRNA表達能夠促進初始CD4+T細胞向Th細胞分化[16]。Th細胞包括Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、Treg和Tfh細胞亞群,各亞群受不同miNRA調節,維持Th細胞亞群之間的分化平衡[17];miRNA的異常表達將導致Th細胞亞群功能失調,誘發自身免疫病。Qi等[7]發現,BD患者CD4+T細胞中miRNA-23b表達水平下降,對Th1和Th17擴增具有調控功能;抑制CD4+T細胞中miRNA-23b表達,顯著增高Th1、Th17細胞數量及相應細胞因子IFN-γ、IL-17表達。B細胞發揮免疫功能的過程同樣受到miRNA等微小分子的調節,Dicer蛋白敲除后的祖B淋巴細胞中miRNA-17～92簇缺乏導致B細胞發育障礙[18]。而在小鼠成熟B淋巴細胞中敲除Dicer蛋白,發現小鼠自身抗體升高[19]。上述研究提示,miRNA在B淋巴細胞發育及免疫調節中發揮作用。正常免疫系統的形成和功能完善需要miRNA參與調節,其表達動態調節免疫細胞分化及成熟免疫細胞發揮免疫功能。相反,miRNA異常表達將導致免疫紊亂、功能異常。

miRNA-23b與BD 早在2002年就有學者提出,Th1細胞是BD的主要致病細胞。近年來發現Th17細胞在BD發病中發揮作用,Th1、Th17分泌釋放IL-17、IL-6、IL-21、IL-8、IFN-γ及TNF-α等細胞因子參與BD的發病[3]。其中,Th17表達水平及相應炎性因子IL-17與BD活動密切相關[2]。Notch1信號通路在Th17細胞分化中發揮著關鍵性作用[8]。Qi等[7]發現,Notch1在活動期BD患者外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、CD4+T細胞中過度激活,抑制Notch1表達可以減輕Th1、Th17炎性反應;3種miRNAs能夠抑制靶蛋白Notch1的,即miRNA-23b、miRNA-21、miRNA-34a,在BD患者CD4+T細胞中進行檢測發現,僅miRNA-23b在活動性BD患者CD4+T細胞中低表達;應用miRNA-23b拮抗劑轉染CD4+T細胞發現,Notch1信號通路過度活化、STAT3磷酸化水平升高;ELISA法檢測Th17相關細胞因子發現,IL-17、IFN-γ表達上調;結果表明,miRNA-23b在CD4+T細胞中低表達與Notch信號通路異常激活相關,通過改變STAT3的磷酸化誘導Th17細胞分化,分泌IL-17、IFN-γ等炎性細胞因子導致BD患者的炎癥發生,促進疾病進展。

miRNA-155與BD Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是固有免疫重要的抗原識別受體,經配體刺激激活后,通過接頭分子MyD88 或TRIF 活化下游信號通路,啟動免疫反應[20]。TGF-β活性激酶1靶蛋白2(TGF-β-activated kinase 1-binding protein 2,TAB2)是TLR/IL-1信號級聯反應的鏈接蛋白,也是miRNA-155的直接靶點[21]。在成熟樹突狀細胞中,miRNA-155可通過作用于TAB2下調炎性因子,負反饋調節免疫反應[22]。Zhou等[9]發現miRNA-155在活動期眼BD患者PBMC和未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cell,imDC)中低表達,而Vogt-小柳原田綜合征患者與健康對照組相比無差異;通過TargetScan和miRNABase等生物信息工具進一步驗證miRNA-155在BD發病中的作用機制,發現miRNA-155能夠與TAB2 mRNA的 3’端非翻譯區(untranslated region,UTR)互補結合,影響TLR/IL-1信號通路過程中級聯反應的靶向蛋白TAB2表達,抑制imDCs分泌IL-6 和IL-1β,促進抗炎因子IL-10表達;結果表明,miRNA-155在BD患者imDCs中低表達,對促炎細胞因子的負向調控減弱而導致BD炎癥發生;下調imDC中miRNA-155水平,并將其與CD4+T細胞共培養發現,IL-17表達顯著升高;相反,miRNA-155高表達則表現為IL-17表達下調,結果提示,miRNA-155表達下調還可以通過影響imDC對T細胞的調節功能在BD中發揮作用。此外,Na等[10]發現,活動性BD患者CD4+T細胞中miRNA-155高表達,通過抑制Ets-1蛋白表達促使IL-17產生,參與BD發病,上述研究結果表明,miRNA-155在BD中可能同時影響多種炎癥通路從而促進疾病發展。

miRNA-146a、miRNA-196a2基因多態性與BD相關 miRNA-146a/rs2910164與BD的發病風險顯著相關,在miRNA-146a/rs2910164 CC型BD患者PBMC中,miRNA-146a及IL-17、TNF-α、IL-1β等炎性因子表達顯著低于rs2910164 GG型,提示miRNA-146a基因多態性可能通過調控自身miRNA的成熟和炎性因子的表達與BD相關[23]。Qi等[11]發現,pre-miRNA-196a2/rs11614913 TT型人群患BD的發病風險顯著升高;進一步研究發現,rs11614913 TT型BD患者PBMC中miRNA-196a表達下調,可能通過靶基因Bach1高表達,IL-1β和MCP-1等炎性因子水平上調與BD相關。miRNA不僅存在于細胞內,而且相對穩定地存在于血液中,這使得其成為生物學標志物的研究具有可行性。因此,進一步研究miRNA-146a、miRNA-196a2及其基因多態性在BD中的作用,將會為臨床診斷及治療提供新的策略。

miRNA作為BD潛在生物學標志物 miRNA不僅具有顯著的生物學相關性,還可能成為BD生物學標志物。近來,Erre等[24]采用TaqMan探針進行了基于低密度陣列miRNA表達譜分析,通過對750種人類miRNA研究,探索了5例BD患者和3例健康對照PBMC中miRNA表達譜,與健康人比較,BD患者13種miRNAs表達異常,包括miRNA-571、miRNA-127、miRNA-573、miRNA-770、miRNA-370、miRNA-139-3p、miRNA-720和miRNA-330表達上調,miRNA-200b、miRNA-520c-3p、miRNA-199a-3p、miRNA-224和 miRNA-98表達下調。對miRNA-139-3p和miRNA-720進行實時熒光定量PCR進一步驗證顯示,BD患者miRNA-139-3p和miRNA-720表達明顯上調,但與BD活動性無關,提示miRNA-139-3p和miRNA-720有可能成為BD診斷的標志物。鑒于miRNA免疫調控網絡的復雜性和目前檢測技術的限制,miRNA作為血液學標志物的臨床應用尚待進一步完善。

miRNA作為BD潛在治療靶點 miRNA在BD患者免疫細胞中存在異常表達,最終通過上調炎性因子水平參與BD的發病,可能有作為BD基因治療靶點的潛能。Choi等[12]發現,miRNA-21在單純皰疹病毒誘導的鼠BD模型及BD患者外周血PBMC中高表達。對BD模型鼠分別應用秋水仙堿和己酮可可堿治療后檢測出淋巴結中miRNA-21表達明顯下調,其中經過己酮可可堿治療的BD鼠皮膚癥狀有所改善;進一步應用miRNA-21拮抗劑驗證體內效應發現,miRNA-21的靶基因PDCD4、RhoB、PD-1和IL-12p35在具有miRNA-21拮抗效應的PBMC中高表達,通過下調相應炎性因子IL-17和IL-6水平,改善BD鼠癥狀和評分。結果提示,BD患者PBMC中高表達的miRNA-21可能通過抑制靶基因表達上調IL-17和IL-6參與BD炎癥,miRNA-21拮抗劑對單純皰疹病毒誘導的鼠BD模型的治療是有效的,該研究成果為BD的治療提供了新的切入點。

結語 至今靶向miRNAs的藥物尚未從實驗室向臨床應用過渡,在這之前探索與BD密切相關的miRNAs及其作用機制,全面了解miRNAs在BD中特異性靶基因、靶蛋白及信號轉導通路將有助于進一步了解BD的發病機制,為BD的預防、治療及判斷預后等臨床實踐提供理論基礎。

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The pathgenetic role and potential clinical application of miRNAs in patients with Behcet’s disease

YE Jing-fen, GUAN Jian-long△

(DepartmentofImmunologyandRheumatology,HuadongHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

As the endogenous mediators of RNA interference,miRNA play biological roles by inducing post-transcriptional silence of gene expression.Previous studies showed that miRNAs have multiple regulating potential to immune cells,involved in regulation of innate and adaptive immunity.Recently,aberrant expression of miRNAs have been confirmed to be relevant to the pathogenesis of Behcet’s disease (BD) by regulating the expression of inflammatory cytokines in immune cells,which may become of its diagnostic marker and therapeutic target in the future.In this review,we discuss how miRNAs regulate autoimmunity.Several miRNAs associate with the pathogenesis of BD,thus they have the potential clinical application value.

miRNA; inflammatory cytokines; Behcet’s disease

R593.1

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.026

2016-08-22;編輯:段佳)

上海衛生系統第二批重要疾病聯合攻關重點項目(2014ZYJB0010)

△Corresponding author E-mail:guanjianlong@medmail.com.cn

*This work was supported by Shanghai Health System Key Joint Research Project on Important Diseases of the Second Batch (2014ZYJB0010).