豬肉及組織中β-受體激動(dòng)劑UPLC-MS/M檢測(cè)方法研究

王志恒 趙 超 陳曉勇 劉亞娟 葛 劍 趙鎖林 趙建立

（1.石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，河北石家莊 050041；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；3.河北畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定 071000；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；5.河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北張家口 075000；6.石家莊市藁城區(qū)畜牧水產(chǎn)局畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)站 河北石家莊 050000；7.石家莊市石藥集團(tuán)新諾威制藥股份有限公司，河北石家莊 051430）

豬肉及組織中β-受體激動(dòng)劑UPLC-MS/M檢測(cè)方法研究

王志恒1趙 超2陳曉勇3劉亞娟4葛 劍5趙鎖林6趙建立7

（1.石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，河北石家莊 050041；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；3.河北畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定 071000；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；5.河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北張家口 075000；6.石家莊市藁城區(qū)畜牧水產(chǎn)局畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)站 河北石家莊 050000；7.石家莊市石藥集團(tuán)新諾威制藥股份有限公司，河北石家莊 051430）

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測(cè)豬肉中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇3種β-受體激動(dòng)劑殘留方法。選用鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解，混合型陽(yáng)離子交換固相萃取凈化，以 0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液-甲醇為流動(dòng)相，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，在 1.0、5.0、10μg/kg濃度添加水平，空白肌肉組織中3 種藥物添加平均回收率范圍84～95%，標(biāo)準(zhǔn)偏差3.6～8.1%。該方法檢測(cè)限為 0.1 μg/kg，定量限為 0.3μg/kg，具有準(zhǔn)確敏感特性。

β-受體激動(dòng)劑；殘留檢測(cè)；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

20世紀(jì)80年代初，美國(guó)一家公司開(kāi)始將鹽酸克倫特羅添加到飼料中，達(dá)到提高瘦肉率的作用，從此β-受體激動(dòng)劑被熟稱(chēng)為“瘦肉精”。β-受體激動(dòng)劑的“再分配效應(yīng)”使動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分由脂肪組織向肌肉組織轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到減少胴體脂肪含量，提高瘦肉率的作用。其作用機(jī)制：（1）降低脂肪含量。進(jìn)入機(jī)體的β-受體激動(dòng)劑與脂肪細(xì)胞膜上的β-受體結(jié)合后，增加胞內(nèi)環(huán)磷酸腺（cAMP），從而加速了脂肪細(xì)胞三酰基甘油的降解[1]。另外β-激動(dòng)劑能促進(jìn)脂肪的分解和抑制脂肪的合成[2]。（2）提高肌肉含量。β-激動(dòng)劑還能促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌和釋放，促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)[3]。

但如果作為飼料添加劑，使用劑量是人用藥劑量的5-10倍，才能達(dá)到提高瘦肉率的效果。若人體誤食了含有此類(lèi)藥物的食品，會(huì)產(chǎn)生頭暈，頭疼，心跳加快，肌肉震顫，口干，惡心，嘔吐等癥狀，對(duì)高血壓，心臟病病人危害更大[4]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中將克倫特羅及其鹽、沙丁胺醇及其鹽和酯、西馬特羅及其鹽和酯列為禁止使用的獸藥，并規(guī)定在動(dòng)物食品中不得檢出。本研究對(duì)豬肉組織酶解，高氯酸：甲醇（9：1，v/v）提取，經(jīng)混合型的PCX柱凈化后，采用UPLC—MS/MS的多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）進(jìn)行檢測(cè)。另外本研究對(duì)基質(zhì)誘導(dǎo)的離子抑制作用進(jìn)行了討論，建立了較好的實(shí)驗(yàn)方案。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 儀器和試劑

超高效液相色譜系統(tǒng)：ACQUITY Ultra Performance Liquid Chromatography 19（UPLC）（日本島津公司）；質(zhì)譜系統(tǒng)：質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司），串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（MS-MS）；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（50x2.1mm i，d 1.7μm）：固相萃取小柱：Bond Elut Plexa PCX（3mL，60mg）：乙腈，甲醇、乙酸乙酯、甲酸、冰乙酸、醋酸銨等為進(jìn)口色譜純；標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺，純度99.5%，購(gòu)于Dr.Ehrcnstorfcr。使用甲醇配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃下棕色瓶中保存。

1.2 樣品處理

稱(chēng)取2.0 g勻質(zhì)好的豬肉樣品于50mL離心管中，加入5.0 ml乙酸銨緩沖溶液（2.0 M，pH 5.2），再加入50μlβ-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻后于37℃下溫育過(guò)夜酶解。酶解后的樣品加入10 ml 0.2 mol/L高氯酸.甲醇（9：1，v/v）的混合液后渦旋混勻3 min。然后在4℃以8000轉(zhuǎn)/min的速度離心15 min，取上層液過(guò)濾到濾膜。殘留物經(jīng)高氯酸-甲醇（9：1，v/v）的混合液重復(fù)提取一次，合并過(guò)濾液待凈化。首先依次用3 ml甲醇，3 ml水活化PCX固相萃取柱，全部上樣后，再依次用3 ml水，3 ml甲醇淋洗，抽至近干后，最后用3 ml含有5%氨水的甲醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于60℃下的氮?dú)庀麓蹈桑褂贸跏嫉牧鲃?dòng)相定容到2.0ml，過(guò)0.22μm的濾膜待UPLC- MS/MS分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50x2.1mm i.d 1.7μm）；柱溫：40℃；樣品室溫度：20℃；進(jìn)樣體積：5.0μL；流動(dòng)相：A相為含0.1%甲酸的水溶液（甲酸：水=0.1：100，V：V），B相為甲醇；線(xiàn)性梯度洗脫程序：0 min時(shí)A為80%，3 min時(shí)A為45%，3.5 min時(shí)，A為80%；流速：0.20 mL/min；檢測(cè)時(shí)間：3.5 min。

1.4 質(zhì)譜條件

離子模式（Ionization Mode）：電噴霧正離子源ESI+；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；源內(nèi)毛細(xì)管電壓：3.5KV；樣品錐孔電壓：50V；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：400℃；錐孔反吹氣；錐孔反吹氣流量：93L·Hr-l；光電倍增管電壓：650V；

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)的酶解方法，即在2.0 mol/L乙酸銨緩沖溶液（pH 5.2）中加入50μlβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶酶解，37℃溫育過(guò)夜。

2.2 提取條件優(yōu)化

豬肉組織基質(zhì)中的蛋白質(zhì)對(duì)電噴霧質(zhì)譜的離子抑制作用很強(qiáng)，使靈敏度明顯降低。為了沉淀豬肉組織中的蛋白質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用0.1%高氯酸一甲醇（（9：l，v/v）對(duì)酶解后的樣品進(jìn)行提取，使蛋白質(zhì)達(dá)到等電點(diǎn)沉淀，從而減少了蛋白質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的干擾。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

本研究起初嘗試使用液液萃?。↙LE）凈化，使用Bond Elut Plexa PCX固相萃取柱是一種混合型的陽(yáng)離子交換柱，Plexa PCX具有強(qiáng)大的表面親水性，鍵合了磺?；木酆衔锘w的羥基化表面，孔內(nèi)部具有疏水性，這種特性使PCX柱經(jīng)活化后，吸附劑具有獨(dú)特的極性梯度表面，更為重要的是蛋白質(zhì)的表面結(jié)合特性最小。

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.4.1 母離子的選擇及優(yōu)化

由于β-受體激動(dòng)劑是一類(lèi)具有弱極性的化合物，再加上電噴霧電離的高靈敏度，易操作等特點(diǎn)，所以電噴霧電離被選擇。首先以10μL/min的流速通過(guò)針泵注入1.0μg/ml β-受體激動(dòng)劑單標(biāo)溶液，在正離子電噴霧模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描。遵循豐度高和質(zhì)量數(shù)大兩個(gè)原則選擇母離子，得到分子離子峰【M+H】+最為理想。

2.4.2 子離子的選擇及優(yōu)化

根據(jù)歐盟2002/657/EC規(guī)定，β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)確證方法需要4個(gè)鑒別點(diǎn)。一個(gè)母離子己獲得1個(gè)鑒別點(diǎn)，還需要兩個(gè)子離子，由每個(gè)子離子獲得1.5個(gè)鑒別點(diǎn)才滿(mǎn)足確證方法的要求。對(duì)每種母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到碎片離子信息。當(dāng)碰撞能量較低時(shí)，只產(chǎn)生質(zhì)量數(shù)較大分子離子碎片，隨著碰撞能量的增加，碎片離子的數(shù)量增加，如沙丁胺醇產(chǎn)生m/z 148，222；萊克多巴胺產(chǎn)生m/z 164，284；鹽酸克倫特羅產(chǎn)生m/z 203，259。

2.5 方法線(xiàn)性范圍，檢測(cè)限，定量限

為了減少基質(zhì)干擾，本文采用向空白基質(zhì)溶液中添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為0.5，1.0，2.0，5.O，10.0，20.0μg/kg的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，在O.5～20.0 m/kg的線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99。方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）以向空白樣品中添加較低濃度的待測(cè)物進(jìn)行測(cè)定，以信噪比大于3的濃度定義為L(zhǎng)OD，信噪比大于10的濃度定義為L(zhǎng)OQ。

2.6 回收率和精密度

取陰性豬肉試樣加入適量待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使最終添加水平為1.O，5.0，10.0μg/kg，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行，平均回收率為84-95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6～8.1%，添加水平為1.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg。

3 小結(jié)

本研究建立了豬肉組織中三種不同極性的β-受體激動(dòng)劑的殘留檢測(cè)方法。2.0 g樣品經(jīng)酶解后，采用高氯酸-甲醇（9：l，v/v）提取并沉淀蛋白質(zhì)，混合型的陽(yáng)離子交換柱（Bond Elut Plexa PCX）凈化后，最后再生到2.0 mL。以甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，以粒徑為1.7μm的BEH C18柱進(jìn)行分離，在ESI+下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下進(jìn)行檢測(cè)，分析時(shí)間只有3.5min。此方法分析時(shí)間短，回收率和檢測(cè)限都令人滿(mǎn)意，還有效的減少了離子抑制現(xiàn)象，可用于日常中豬肉組織中β-受體激動(dòng)劑的殘留檢測(cè)。

[1] Petefla T，Scanes C.Effect of beta—adrenergic agonists on lipolysis and lipogenesis by porcine adipose tissue in vitro[J].Journal of AnimalScience，1990，68（4）：1024.

[2] Orcutt AL，Cline TR，Mills SE.Influence of the beta一2一adrenergic agonist clenbuterol on insulin·stimulated lipogenesis in mouse adipocytes[J].1989，6（1）：59-69.

[3] Salem M，Levesque H，Moon TW，Rexroad CE，Yao J.Anabolic effects of Feeding[beta] 2-adrenergic agonists On rainbow trout muscle proteases and proteins[J].Comparative Biochemistry and Physiology-Part A：Molecular&Integrative Physiology，2006，144（2）：145-154.

[4] 陶金才.食品安全監(jiān)督管理體系分析[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

王志恒（1981—），男，河北省石家莊市人，畜牧師，碩士研究生，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)。