釀酒酵母組蛋白H3K56A突變菌株的構建及其對細胞生長的影響

薛濤濤++邊金++伍陸++趙秀娟++崔向軍++蔡祿

摘要：組蛋白修飾，例如甲基化、乙酰化等修飾對基因表達和細胞生長至關重要。為揭示組蛋白H3第56位賴氨酸（K）修飾對酵母細胞生長的重要性，構建H3K56定點突變為丙氨酸（A）的組蛋白突變株H3K56A，并對其在高溫、高鹽等條件下的生長狀況進行初步檢測。根據酵母同源重組的原理，采用兩步替換法構建H3K56A突變菌株，用分光光度法測定突變菌株的生長曲線，并分別在高鹽、高溫條件下檢測突變體的表型。結果表明，釀酒酵母組蛋白H3K56A突變菌株構建成功，其生長曲線與野生型無明顯差異；H3K56A突變株對高溫、高鹽條件均較敏感，且在高鹽條件下，菌體生長緩慢、菌落偏小，表明組蛋白H3K56位點的修飾可能與釀酒酵母抗高鹽、高溫機制有關。

關鍵詞：釀酒酵母；H3K56A突變菌；組蛋白修飾；兩步替換法；同源重組；高鹽環境；高溫環境；抗逆機制

中圖分類號： S188文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0077-05

收稿日期：2015-11-02

基金項目：國家自然科學基金（編號：61361014、31260274）；內蒙古自然科學基金（編號：2015MS0334）。

作者簡介：薛濤濤（1990—），女，山西臨縣人，碩士研究生，主要從事表觀遺傳學研究。E-mail：xuetaotao196485@163.com。

通信作者：趙秀娟，博士，教授，主要從事表觀遺傳學研究。E-mail：zhaoxiujuan@imust.cn。

核小體是真核生物細胞內染色質的基本組成單位，它由147 bp的DNA纏繞核心組蛋白八聚體形成[1]，組蛋白H1與2個核小體之間有40～60 bp的連接DNA以穩定核小體的結構[2]。組蛋白八聚體具有球狀的三維結構，而蛋白質氨基端則游離在三維球形的表面，游離氨基端的氨基酸殘基可以被共價修飾[3]。在釀酒酵母中，編碼核心組蛋白H2A、H2B、H3、H4的基因都有2個拷貝，主要的核心組蛋白基因組成4個基因座，每個基因座包含2個組蛋白基因，這2個基因共用1個中心啟動子并以不同的方向進行轉錄。編碼組蛋白H3、H4的2個基因分別為HHTI-HHF1、HHT2-HHF2，分別位于Ⅱ號、XIV號染色體上[4]，在基因組中這2個拷貝只要有1個存在，便可維持細胞的正常生存[5]。組蛋白H2A、H2B的2個基因座分別為HTA1-HTBI、HTA2-HTB2，它們編碼幾乎相同的組蛋白H2A、H2B[6]。與組蛋白H3/H4不同的是基因座HTA1-HTBI對于細胞的生存是必需的，但HTA2-HTB2卻不是。組蛋白上能發生共價修飾的氨基酸殘基稱為修飾位點，組蛋白修飾主要發生在組蛋白的N-末端殘基上[7]。常見的修飾種類包括組蛋白乙?；?、甲基化、泛素化、磷酸化，以及研究較少的小泛素相關修飾物（small ubiquitin-related modifier，簡稱SUMO）化、生物素化等[8]。其中賴氨酸、精氨酸的甲基化，絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化，賴氨酸的乙?；⒎核鼗?、SUMO化在酵母核心組蛋白中都被檢測出來，而且這些修飾大多數都是可逆的[9]。近年來研究表明，組蛋白修飾在調控基因表達和細胞生長等生命活動中起重要的調控作用。

通過組蛋白翻譯后修飾的染色質的表觀遺傳學變異對于環境因素誘導引起的基因轉錄的變化是很重要的。然而，在外界環境刺激下組蛋白修飾是如何被調控的目前還知之甚少，但是這種表觀遺傳調控途徑對細胞適應與抵御外界不良環境卻極為重要[10]。細胞外、細胞內的環境變化都會引起核染色質的變化，從而調控基因的表達，但是目前對這種調控機制的研究并不是很深[11]。外界環境變化信號如養分的缺失、鹽離子脅迫和溫度的變化等都會影響基因的表達及細胞的發育[12]。為研究組蛋白乙酰化修飾對細胞生長的影響，并探討組蛋白修飾在釀酒酵母應對外界環境壓力時所起的作用，本研究以釀酒酵母為材料，構建H3K56突變為丙氨酸（A）的組蛋白突變菌株，對其生長曲線進行測定，并在高鹽、高溫條件下與其他位點修飾突變菌株的生長狀況進行比較。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質粒釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4741：MATa ura3Δ0 hisΔ0 leu2Δ0 met15Δ0；質粒pAG25由內蒙古科技大學基因工程實驗室保存。組蛋白H3基因突變質粒pBB6-Hhf2-hht2K56A由戴俊彪實驗室提供。

1.1.2試劑、酶與引物卡那霉素、鮭魚精DNA，購自北京索來寶科技有限公司；諾爾斯菌素，購自北京啟維益成科技有限公司；乙酸鋰，購自美國MYM生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶，購自TaKaRa；BciⅥ酶，購自NEB BioLabs；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2引物設計

本研究所設計引物見表1，其中引物Nat-F、Nat-R的小寫部分分別為HHT1-HHF1基因的左右同源臂序列，引物A、B、C、D、Kan B、Kan C為第1步替換鑒定所用引物，引物P1、N1、P2為第2步替換鑒定所用引物。引物位置見圖1。

1.3釀酒酵母Ⅱ號染色體HHT1-HHF1基因敲除

1.3.1NAT基因的擴增參照Dai等的方法[13]，以質粒pAG25為模板擴增NAT基因，同時在其上下游引物5′端分別加上Ⅱ號染色體組蛋白H3/H4基因左右同源序列，經PCR擴增后得到左右兩側含有組蛋白H3/H4基因左右同源序列的NAT基因。PCR反應體系：5 μL 10×Ex Buffer（Mg2-），3 μL MgCl2，4 μL dNTPs，1.5 μL正向引物（10 μmol/L），1.5 μL 反向引物（10 μmol/L），1.5 μL模板（pAG25，100 ng/L），0.3 μL Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）；加ddH2O至50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min。

1.3.2酵母轉化采用醋酸鋰轉化法[14]，接種酵母菌BY4741單菌落至YPD液體培養基中進行過夜培養，轉接過夜培養的菌液至新的YPD液體培養基中，至D600 nm為0.1，于30 ℃培養至D600 nm為0.6～1.0；收集細胞，用0.1 mol/L LiAc/TE 清洗細胞，重懸細胞于100 μL 0.1 mol/L的LiAc/TE中；取2 μL上述PCR產物進行轉化，轉化緩沖液體系：312 μL 50% PEG3350、41.4 μL 1 mol/L LiAc、47.9 μL二甲基亞砜（DMSO）、25 μL 10 mg/mL 鮭魚精DNA（用前用沸水煮 5 min），30 ℃孵育30 min，42 ℃熱激15 min；收集細胞，用5 mmol/L CaCl2清洗細胞，加1 mL YPD液體培養基，30 ℃孵育6 h；用ddH2O清洗細胞，在無菌操作臺中用含有 100 μg/mL 諾爾斯菌素在YPD固體培養基上涂板。

1.3.3陽性菌落的鑒定挑取平板上的單菌落于YPD液體培養基中，于30 ℃培養，提取基因組，用鑒定引物進行PCR擴增，選取成功替換的陽性克隆。PCR鑒定反應體系：2 μL 10×Buffer（Mg2+），1.5 μL dNTPs，0.1 μL正向引物（10 μmol/L），0.1 μL反向引物（10 μmol/L），1 μL模板（基因組）（700 ng/μL），0.1 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）；加ddH2O至15 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，30個循環；72 ℃ 10 min。

1.4釀酒酵母XIV號染色體HHT2-HHF2基因定點突變

1.4.1pBB6-Hhf2-hht2K56A突變質粒的提取與酶切過夜培養含pBB6-Hhf2-hht2K56A突變質粒的大腸桿菌DH5α，用試劑盒法提取質粒，用BciⅥ進行酶切，酶切體系：8 μL 質粒DNA（350 ng/μL），5 μL NEB Buffer4（10×），0.5 μL BciⅥ（10 000 U/mL）；加ddH2O至50 μL，37 ℃酶切 2 h。

1.4.2酵母轉化接種“1.3.3”節所鑒定的Ⅱ號染色體HHT1-HHF1基因敲除的酵母菌進行培養，取10 μL酶切產物進行轉化，轉化緩沖液體系及步驟同“1.3.2”節。轉化后在尿嘧啶缺陷型酵母培養基（簡稱SC-Ura）固體培養基上涂板。

1.4.3H3K56A突變菌株的鑒定挑取單菌落于YPD液體培養基上，于30 ℃培養，提取基因組，用鑒定引物進行PCR擴增，選取成功替換的陽性克隆。PCR鑒定反應體系參照“1.3.3”節。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 7 min。

1.5生長曲線的測定

對野生菌株BY4741、Ⅱ號染色體HHT1-HHF1基因敲除菌株、XIV號染色體組蛋白H3K56A定點突變菌株分別進行生長曲線的測定。分別取3個裝有250 mL YPD液體培養基的三角甁，加入體積分數1%的已活化18 h的酵母培養液，30 ℃、200 r/min搖床培養。在培養2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h時取培養液，以未接種的YPD液體培養基作參比，使用分光光度計測定600 nm處的吸光度D600 nm。

1.6H3K56A突變菌株表型及抗高鹽、高溫能力檢測

為了研究H3K56位點進行的修飾對釀酒酵母細胞生長的重要性，分別接種組蛋白H3K14A、H3K14R、H3K56A、H3K79A突變菌株與野生菌株BY4741、Ⅱ號染色體HHT1-HHF1基因敲除菌株于YPD液體培養基中，30 ℃、200 r/min過夜培養，調整過夜培養各樣品至同一濃度，每個菌株做5個濃度梯度稀釋，每個濃度取5 μL進行接種，使其總接種細胞數分別為10 000、2 000、400、80、16個。試驗組接種培養基為普通YPD固體培養基與含1 mol/L NaCl的YPD固體培養基，接種后分別在39、30 ℃條件下進行培養；對照組接種培養基為普通YPD固體培養基，于30 ℃培養。觀察菌株生長狀況，培養至3 d時拍照。

2結果與分析

2.1HHT1-HHF1基因敲除菌株的構建及鑒定

質粒pAG25大小為3 704 bp，圖2為質粒在0.8%瓊脂糖凝膠電泳中得到的電泳結果。以質粒pAG25為模板擴增所得NAT基因大小約為1 300 bp，NAT基因1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果（圖3）顯示，目的條帶與實際大小相符。上述PCR擴增產物經過乙酸鋰轉化，在含有諾爾斯菌素的YPD固體培養基上成功獲得轉化子。挑取轉化子，提取其基因組進行PCR驗證。由圖4可見，點樣孔1、3沒有擴增出產物，而點樣孔2、4擴增出約800 bp的片段，表明該菌落Ⅱ號染色體HHT1-HHF1成功被NAT基因替換，已成功鑒定出陽性菌株。

2.2H3K56A突變菌株的構建及鑒定

組蛋白H3修飾突變質粒pBB6-Hhf2-hht2K56A上有BciⅥ酶的4個酶切位點，酶切片段大小分別為4 071、2 575、1 527、613 bp，其中4 071 bp大小的片段上含有組蛋白H3突變基因HHTs-HHFS、URA3基因、組蛋白H3/H4基因HHT2-HHF2左右同源序列。質粒經酶BciⅥ酶切結果見圖5，酶切產物經乙酸鋰轉化后，在SC-Ura平板上得到轉化子。以轉化子基因組為模板進行擴增，擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。由圖6可見，樣孔1以P1+P2為引物PCR擴增出1段約700 bp的片段，而樣孔2以P1+N1為引物則沒有擴增出片段，表明其XIV號染色體HHT2-HHF2基因已被H3K56A突變基因替換。

2.3生長曲線的測定

由圖7可知，釀酒酵母的生長在前4 h處于調整期，4～10 h酵母生長處于對數期，10 h以后處于穩定期。對野生菌株BY4741、Ⅱ號染色體NAT突變菌株、XIV號染色體組蛋白H3K56A突變菌株的生長曲線進行比較可知，其生長期無明顯差異，說明組蛋白H3K56A突變對于酵母菌的生長期無明顯影響。

2.4菌株表型及抗高鹽、高溫能力檢測

組蛋白K3K56A突變后該位點將不能被乙?；揎棧M蛋白H3K56位點的乙?；揎棇τ贒NA的復制、轉錄和DNA損傷修復等生物學過程卻是必不可少的。筆者將H3K56A突變菌株與其他位點突變菌株H3K14A、H3K14R、H3K79A和單拷貝組蛋白H3/H4基因Ⅱ號染色體NAT突變菌株、野生BY4741菌株分別在高溫、高鹽脅迫下的表型進行比較。由圖8-A可以看出，在正常培養條件下，失去Ⅱ號染色體1個H3/H4基因拷貝后的hht1Δhhf1Δ菌株生長情況與野生型并無多大區別，說明對于組蛋白H3/H4來說，只須保證它在基因組中有1個拷貝便可滿足其正常生長。其他4種組蛋白突變株H3K14A、H3K14R、H3K56A、H3K79A的生長情況正常，說明這4個組蛋白修飾位點的突變并沒有對酵母的正常生存造成影響。由圖8-B、圖8-C可見，在高鹽、高溫脅迫下，H3K56A突變體生長情況不如其他菌株，說明在對抗高鹽、高溫不利環境條件方面，H3K56位點的修飾可能更為重要。同時對比圖8中A、B、C3種條件下菌落生長情況還可以看出，在高鹽脅迫下所有菌株的菌落生長緩慢，表明高鹽可能會抑制酵母細胞菌落的生長。

3討論

組蛋白特定位點的乙酰化、甲基化等修飾與DNA的復制及轉錄調控等生物學過程密切相關。組蛋白的乙?；谌旧|轉錄活性的激活過程中起重要作用[15]，目前人們對組蛋白K3K56位點的乙酰化修飾研究較為深入。組蛋白H3K56ac在啟動子區域通過破壞核小體上DNA進出口處組蛋白H3與DNA的相互作用，從而促進核小體的分解，進而促使轉錄的起始[16]。在釀酒酵母中，組蛋白H3K56的乙?；峭ㄟ^組蛋白分子伴侶Asf1、乙酰轉移酶Rtt109來調節的，在表觀遺傳水平上通過與其他因子的相互作用來調控基因的表達[17]。本研究采用2步替換法來構建H3K56A突變株，首先采用PCR的方法擴增NAT基因，由于其引物5′端添加了40 bp 的H3/H4基因左右同源序列，擴增產物通過乙酸鋰轉化試驗，在基因組復制過程中可以與Ⅱ號染色體上基因H3/H4發生同源重組，從而成功敲除了Ⅱ號染色體上基因H3/H4拷貝1而得到NAT突變菌株，通過檢測其生長曲線與生長表型及部分敏感性試驗，表明H3/H4基因缺失1個拷貝后并不會對酵母的正常生長造成影響，這既為第2步XIV號染色體組蛋白定點突變試驗奠定了基礎，又可排除突變后表型的差異是因為缺失了1個拷貝而引起的可能性。第2步替換由于H3/H4定點突變基因較長，因此筆者對含有突變基因的質粒pBB6-Hhf2-hht2K56A進行酶切并獲得含有H3/H4左右同源臂的H3/H4基因H3K56A定點突變基因，同樣通過乙酸鋰轉化法得到H3K56A突變株。通過本研究提供的方法進行突變體的構建，轉化效率較高，操作簡便，可以成功得到組蛋白定點突變菌株，這為研究組蛋白H3K56ac修飾的生物學功能奠定了基礎。

通常情況下，微生物都有能力應答外界不良環境的刺激，這些應激幾乎是微生物都具有的基本能力，包括營養水平的改變、滲透壓失衡、氧化應激和溫度變化等不良條件[18]。多細胞生物及可以運動的生物體一般都可以通過能動的位置的或生理機能的調節改變來避免這些不利的生存環境，但是對于單細胞生物如酵母來說，它們受外界環境的支配，要么適應這種環境，要么死亡[19]。釀酒酵母是一種典型的模式生物，其對環境壓力應答的研究是真核細胞生物學研究的重要組成部分，而轉錄激活在這個過程中起重要作用[20]。目前對組蛋白修飾在酵母抗逆過程中所起作用研究甚少，本研究對H3K56A定點突變菌株進行高鹽、高溫敏感性試驗，對組蛋白修飾在外界不良環境脅迫下所起作用進行初步探索，為組蛋白H3K56位點修飾的研究提供了新的參考。

4結論

本研究通過兩步替換法成功獲得了組蛋白H3K56A突變株，使得組蛋白H3K56位點不能被乙?；揎?，為構建組蛋白修飾突變體提供了1種簡易而高效的方法，并且為研究組蛋白H3K56ac修飾的生物學功能奠定了基礎。通過高鹽、高溫敏感性試驗表明，酵母H3K56ac與酵母抗高溫、高鹽機制有關。

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