長順綠殼蛋雞PRL基因的克隆及序列分析

韓雪++朱麗莉++粟朝芝++吳松成++陶宇航

摘要：采用特異性引物PCR技術獲得長順綠殼蛋雞PRL基因，將其克隆至pGM-T載體，并對該序列進行測序分析。結果表明，長順綠殼蛋雞PRL基因全序列長度為690 bp，包含5個外顯子和4個內含子，編碼229個氨基酸。將長順綠殼蛋雞PRL基因與GenBank已公布的雞、鴨、鵝、魚等動物的PRL基因序列進行同源性比較，發現親緣關系越遠則同源性越低。

關鍵詞：長順綠殼蛋雞；催乳素基因；克隆；序列分析

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0082-03

收稿日期：2015-10-13

基金項目：貴州省科學技術基金（編號：黔科合J字[2011]2174）；貴州省農業科學院研究生創新基金（編號：黔農科合[創新基金]2010011）；貴州省動植物育種專項（編號：黔農育專字[2011]027）；貴州省農業科學院專項（編號：黔農科院院專項[2014]006號）。

作者簡介：韓雪（1982—），女，江蘇徐州人，碩士，助理研究員，主要從事動物遺傳育種研究。E-mail：hanxue8855601@126.com。

通信作者：陶宇航，副研究員，主要從事家禽養殖研究。E-mail：1043694421@qq.com。

催乳素（prolactin，PRL）是動物垂體前葉嗜酸細胞分泌的一種多肽類激素，對哺乳動物的乳腺發育、泌乳、卵巢功能、維持妊娠、機體免疫等具有重要的生物學效應[1]。在家禽中，PRL是促進母禽就巢孵卵行為和調控生殖活動的關鍵激素[2]，就巢期間PRL表達量升高可抑制垂體促性腺激素的分泌，致使卵巢萎縮，排卵泡停止，最終終止產蛋[3]。很多物種PRL基因的cDNA或基因全序列已被測定，其轉錄產物在不同物種中高度保守。對人、雞、鴨、鵝等動物的研究表明，PRL基因由5個外顯子和4個內含子構成。禽類PRL前體含229個氨基酸，其中包括30個氨基酸的信號肽序列和199個氨基酸的PRL成熟蛋白[4]。

長順綠殼蛋雞因其產地地處貴州省長順縣而得名，是中國稀有的珍禽品種。長順綠殼蛋雞是在貴州省特定自然生態環境下，經長期自然選擇和人工選擇而形成的品種，具有耐粗飼、抗病力強、覓食能力強等特點。然而，長順綠殼蛋雞產蛋量低、就巢性強，嚴重限制了其產業化發展。以長順綠殼蛋雞為研究對象，克隆其催乳素基因并進行測序分析，為長順綠殼蛋雞品種資源的保護利用及其產蛋性能的提高提供依據。

1材料與方法

1.1材料

血樣采自貴州省長順縣長寨鎮新民村長順綠殼蛋雞純種繁殖場，翅靜脈采血，共采取30羽長順綠殼蛋雞的血樣。所有母雞均在相同環境下單籠飼養，采取的血樣經EDTA抗凝劑抗凝，送至實驗室于-20 ℃保存備用。

1.2方法

1.2.1DNA提取

采用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取血樣中的DNA。

1.2.2引物設計

根據GenBank已公布的禽、鼠等PRL基因序列，采用Primer 5.0軟件在序列保守區設計引物，引物序列見表1，由北京鼎國生物技術有限公司合成。

1.2.3PCR擴增與測序

50 μL PCR反應體系為10×PCR Buffer 5 μL、dNTP（10 μm） 1 μL、Template 1 μL、primer-F（10 μm） 1 μL、primer-R（10 μm） 1 μL、rTaqDNA聚合酶（2 U/μL） 0.5 μL，最后采用ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52～47 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共50個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京鼎國生物技術有限公司進行克隆和測序。

1.3數據處理

將PRL基因5個外顯子片段進行拼接，并采用GenBank數據庫進行BLAST分析。同時，將cDNA序列翻譯成氨基酸序列，確定正確的開放閱讀框（open readingf rame，ORF）；采用DNAman軟件（www.dnastar.com）對長順綠殼蛋雞PRL基因序列與GenBank數據庫公布的其他動物PRL基因序列進行核苷酸、氨基酸序列同源性比較及生物信息學分析。

2結果與分析

2.1長順綠殼蛋雞PRL基因的PCR擴增

以長順綠殼蛋雞血總DNA為模板，利用5對特異引物分別進行PCR擴增，擴增產物與預期片段大小吻合，引物擴增結果見圖1。

2.2重組質粒的酶切鑒定

將重組質粒導入大腸桿菌，經過藍白斑和抗性篩選，提取陽性大腸桿菌并進行質粒提取，然后對質粒進行EcoRⅠ酶切鑒定。結果表明，重組質粒構建成功，將陽性克隆送至北京鼎國生物技術有限公司測序，最后對其外顯子序列進行拼接。

2.3長順綠殼蛋雞PRL基因的序列測定

序列測定結果（圖2）表明，長順綠殼蛋雞PRL基因 cDNA 片段長690 bp，共編碼229個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。

[FK（W13][TPHX1.tif]

[FK（W22][TPHX2.tif]

2.4PRL基因核苷酸和氨基酸序列同源性比較

將長順綠殼蛋雞PRL基因序列與GenBank數據庫上獲取的雞、鴨、鵝、魚等動物的PRL基因序列（表2）進行同源性分析。由表3可知，禽類PRL基因編碼區序列具有高度的保守性。其中，長順綠殼蛋雞與白來航、太和絲羽烏骨雞、隱性白洛克的核苷酸序列同源性最高，為99.9%；與尖嘴鱸的同源性最低，僅為47.3%。氨基酸序列同源性比較可得到與核苷酸序列相似的結果。

2.5系統發育分析

將PRL基因序列繪制進化樹（圖3）。遺傳進化分析表明，長順綠殼蛋雞與楊山雞、太和絲羽烏骨雞、白來航的親緣關系較近，與人、鯉魚、尖嘴鱸的親緣關系較遠。

3結論與討論

大多數研究者認為，PRL是促進母禽就巢孵卵行為和調控[CM（25]生殖活動的關鍵激素[5]，過高和過低的催乳素均對卵泡發

育不利[6]。Dawson等研究發現，火雞和鴿剛就巢時，PRL顯著升高以維持正常的孵化期[7]。Reddy等研究發現，催乳素水平與雞的產蛋量呈負相關[8-9]。PRL必須通過受體作用于靶細胞，[JP2]從而產生各種生理效應。目前，關于催乳素受體基因（prolactin receptor，PRLR）與家禽就巢性之間的相關性研究表明，二者間相關不顯著[10]。雌激素受體基因（estrogen receptor，ER）、VIP、垂體特異轉錄因子（pituitary-specific transcription factor，POU1F1）基因等也會影響家禽就巢性，因此這些基因也是就巢性候選基因[11]。雖然學者已對這些基因開展了大量研究，但均側重于單基因研究，為揭示其就巢性機理，必須從PRL表達調控信號通道進行更系統的研究。

本研究結果表明，長順綠殼蛋雞PRL基因編碼區序列全長為690 bp，共編碼229個氨基酸，基因推導的蛋白分子量為 29.122 ku，理論等電點pI為5.94，表明編碼肽鏈偏酸性。PRL氨基酸殘基二級結構由41.58% α-螺旋、14.34% β-折疊、44.07%無規卷曲3種結構組成。將克隆獲得的長

[FK（W25][TPHX3.tif]

順綠殼蛋雞PRL基因與GenBank數據庫公布的雞、鴨、鵝、魚等動物的PRL基因序列進行同源性比較，發現長順綠殼蛋雞與禽類的同源性均高于90%，氨基酸序列同源性高于90%。與其他動物PRL基因相比較，發現親緣關系越遠則同源性越低。同源分析結果表明，禽類PRL基因編碼區序列高度保守，可見物種分化以后，作為影響哺乳動物產乳性狀的PRL發生了較大變異，這為PRL特性和作用機理的進一步研究以及哺乳動物產乳和繁殖性能的改良提供依據。

在禽類進化的過程中，家雞、火雞、鵪鶉首先發生分支，而鵝與鴨的分支則較晚，這與序列分析結果一致。由于起源與進化不同，長順綠殼蛋雞與原雞、白來航、楊山雞、太和絲羽烏骨雞、隱性白洛克聚為一類，再與鵪鶉、火雞、印度孔雀聚為一類，分支最外側的為人、鯉魚、尖嘴鱸。長順綠殼蛋雞、原雞、白來航、楊山雞等禽類與魚類的親緣關系相對較遠，這與古生物學、形態學、生化遺傳學、細胞遺傳學以及其他DNA分子水平上的分類結果基本一致，這也佐證了PRL基因全序列適合用于研究動物種間系統進化關系。

[HS2*2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

[1][ZK（#]Bole-Feysot C，Goffin V，Edery M，et al. Prolactin（PRL）and its receptor：actions，signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice[J]. Endocrine Reviews，1998，19（3）：225-268.

[2]Elkins P A，Christinger H W，Sandowski Y，et al. Ternary complex between[KG*1]placental[KG*1]lactogen[KG*2/3]and[KG*2/3]theextracellular[KG*2/3]domain[KG*2/3]of[KG*2/3]the [JP2]prolactin receptor[J]. Nature Structural & Molecular Biology，2000，7

[3]Chaiseha Y，Mohamed E，Halawani E L. Neuroendocrinology of the female turkey reproductive cycle[J]. Journal of Poultry Science，2005，42（2）：87-100.

[4]Freeman M E，Kanyicska B，Lerant A，et al. Prolactin：structure，function，and regulation of secretion[J]. Physiological Reviews，2000，80（4）：1523-1631.

[5][JP3]Yen C F，Lin H W，Hsu J C，et al. The expression of pituitary gland[JP2]genes in laying geese[J]. Poultry Science，2006，85（12）：2265-2269.

[6]Larsen C M，Grattan D R. Prolactin，neurogenesis，and maternal [JP2]behaviors[J]. Brain Behavior and Immunity，2012，26（2）：201-209.

[7]Dawson A，Sharp P J. The role of prolactin in the development of reproductive photorefractoriness and postnuptial molt in the European [JP3]starling（Sturnus vulgaris）[J]. Endocrinology，1998，139（2）：485-490.

[8]Reddy I J，David C G，Sarma P V，et al. The possible role of prolactin in laying performance and steroid hormone secretion in domestic hen （Gallus domesticus）[J]. General and Comparative Endocrinology，2002，127（3）：249-255.

[9]陳興勇，何艷，時丹，等. 皖西白鵝催乳素基因克隆、表達及主動免疫后就巢行為分析[J]. 揚州大學學報：農業與生命科學版，2014，35（2）：33-37.

[10]Jiang R，Xu G. Association of polymorphisms for prolactin and prolactin receptor genes with broody traits in chickens[J]. Poultry Science，2005，84（6）：839-845.

[11]姜潤深，楊寧. 家禽垂體特異轉錄因子POU1F1研究進展[J]. 遺傳學，2004，26（6）：957-961.