黃瓜缺銅響應轉錄因子CsSPL7的克隆及表達分析

摘要：結合黃瓜基因組數據和生物信息學分析，采用同源擴增技術從黃瓜津研4號葉片中獲得1個受缺銅誘導表達的基因，命名為CsSPL7。該基因全長1 746 bp，編碼582個氨基酸，與擬南芥SPL7基因序列相似性為43%。QRT-PCR表達分析表明，CsSPL7是1個受缺銅誘導表達的基因，在缺銅處理的黃瓜葉片中表達量最高，并且隨著銅處理濃度的升高，其表達量逐漸降低。研究結果為下一步分析CsSPL7在黃瓜缺銅脅迫過程中的功能奠定了基礎。

關鍵詞：CsSPL7基因；黃瓜；銅；QRT-PCR；同源克隆

中圖分類號： S642.201文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0088-03

收稿日期：2015-10-19

基金項目：黑龍江省青年科學基金（編號：QC2010089）。

作者簡介：杜亞琳（1980—），女，河南郾城人，碩士，實驗師，研究方向為園藝作物生物技術。E-mail：duyalin123@163.com。

銅（Cu）是植物生長和發育必需的微量元素，許多代謝過程，例如光合作用、線粒體電子傳遞、呼吸作用、活性氧代謝、細胞壁結構改變以及乙烯反應等，均需要銅作為輔助因子[1-2]。由于銅在發育過程中的重要意義，銅動態平衡在植物體內處于一種精細調控的狀態。植物體內的銅濃度在不同物種以及不同外源銅環境條件下存在一定差異[3]。

目前，人們通過對植物銅缺失突變體的研究，已經初步明確植物對銅的吸收和積累機制。缺銅脅迫條件下，植物通過調控銅吸收和轉運已經獲得了精細調控體內銅動態平衡的機制[4-5]。例如擬南芥通過提高銅的吸收和獲取量來應對缺銅脅迫。缺銅脅迫會上調擬南芥銅轉運蛋白基因的表達，如ZIP2、ZIP4、FRO3等[6-7]。此外，缺銅脅迫時，在轉銅伴侶CCH基因作用下，衰老過程中銅會在各組織間重新分配[8]。此外，研究表明，擬南芥SPL7是植物缺銅反應過程中的一個核心調控因子，在低銅條件下，銅轉運蛋白基因（COPT1、COPT2、ZIP2、YSL2）、轉銅伴侶基因（CCH、CCS）、FRO3、FRO4、FRO5和FSD1在spl7突變體中也均調控失衡[9-10]。此外，一些新鑒定出的缺銅響應蛋白同樣受到SPL7的調控[10]。上述有關植物吸收和積累銅機制研究，暗示SPL7在植物響應缺銅脅迫過程中的重要調控作用，為深入研究農作物（如黃瓜）銅脅迫的生理與分子機制鑒定了基礎。

黃瓜為一種重要的蔬菜作物，在世界范圍內廣泛栽培。隨著工業、農業對含重金屬材料的使用，以及排放的化學物質種類、數量的增加，重金屬（如銅）污染的土壤面積日益擴大，使環境污染日益嚴重，造成農作物產量和品質下降、優良品種退化迅速，從而制約農業的發展，進而會威脅生態安全，影響農產品的品質，并通過食物鏈危及人類健康。盡管人們對植物缺銅響應機制的相關研究取得了較大進展，但是目前人們仍不能清晰闡述銅脅迫條件下植物（如黃瓜）調控銅動態平衡的生理與分子機制。通過基因工程改造植物基因培育高生物產量的重金屬超積累植物是一個可行的途徑，要實現這一目標，首先要明確植物對銅的吸收積累機制。因此，探討黃瓜耐銅脅迫生理與分子機制具有重要的理論和實踐意義。本研究擬克隆黃瓜CsSPL7基因，并對其序列和在缺銅脅迫條件下的表達模式進行分析，從而為后續利用基因工程技術研究該基因的功能及培育耐銅脅迫的黃瓜新品種奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為黃瓜津研4號，購自天津科潤黃瓜研究所。2015年春季在東北農業大學園藝實驗站人工氣候室內常規種植。在苗期，分別取同一植株的葉片（最頂部幼嫩葉片），用液氮冷凍并于-80 ℃保存，用于RNA的提取。

1.2銅處理

黃瓜植株采用水培方式進行栽培。采用MGRL營養液配方[含1.512 mmol/L NaH2PO4·2H2O、0.257 mmol/L Na2HPO4·12H2O、1.5 mmol/L MgSO4·7H2O、2.0 mmol/L Ca（NO3）4·4H2O、3.0 mmol/L KNO3，67 μmol/L Na2EDTA·2H2O、8.6 μmol/L FeSO4·7H2O、10.3 μmol/L MnSO4、1.0 μmol/L ZnSO4.7H2O、30 μmol/L H3BO3、24 nmol/L（NH4）6Mo7O24·4H2O、130 nmol/L CoCl2·6H2O]，分別添加不同濃度的CuSO4（0、1、5、25、50 μmol/L）進行處理，3 d更換1次營養液。

1.3總RNA的提取及單鏈cDNA反轉錄

總RNA的提取采用TRIzol（Invitrogen）法進行，具體操作參照說明書。隨后用RNase Free DNase I（TaKaRa）處理總RNA，以去除殘留的基因組DNA。單鏈cDNA合成采用MBI公司的逆轉錄（RT）試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）進行，具體操作參考試劑盒說明書。

1.4黃瓜CsSPL7基因的克隆

根據文獻檢索結果，選取擬南芥SPL7（AT5G18830）基因，在Tair（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網站搜索其基因序列，并將其基因序列在黃瓜基因組（http：//www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome/cuke.cgi）網站中進行比對，獲取其在黃瓜中的同源序列，進而以黃瓜基因組中基因同源序列為模板，利用Primer Primer 5.0設計特異引物（正義引物：5′-ATGGAAAGTGATCGATCAAGCATGC-3′；反義引物：5′-TTACAACTTATCTATCAAGCATCTG-3′），以黃瓜津研4號幼嫩葉片cDNA為模板，擴增黃瓜SPL7基因全長cDNA序列。擴增產物采用北京百泰克生物技術有限公司DNA凝膠回收試劑盒回收，插入pGEM-T Easy載體（美國Promega公司），熱激法轉化到E.coli DH5α感受態細胞，在氨芐青霉素平板上進行陽性克隆篩選，送上海英駿生物技術有限公司測序。

[BT2+*5]1.5生物信息學以及熒光定量PCR（簡稱QRT-PCR）分析

將克隆獲得的CsSPL7基因序列在NCBI中進行同源比對分析。同時以經不同銅濃度處理的黃瓜津研4號葉片為材料，以黃瓜CsSPL7基因的cDNA序列為基礎，利用Primer Primer 5.0設計特異引物（正義引物：5′-GGGCAACATACTTGTTTAC-3′；反義引物：5′-GTCAAGATACTTTCCACCA-3′），以β-actin作為內參，用于黃瓜CsSPL7基因的QRT-PCR分析。QRT-PCR反應總體系為20 μL，包括10 μL Real Master Mix SYBR Green Ⅰ[天根生化科技（北京）有限公司]、各1 μL特異引物（20 μmol/L）、0.5 μLcDNA模板、7.5 μL ddH2O。實時定量PCR所使用儀器為IQ5實時定量PCR儀（伯樂公司），試驗結果采用2-△△CT方法來計算基因相對表達量。試驗重復3次。

2結果與分析

2.1黃瓜CsSPL7基因的克隆與序列分析

以擬南芥SPL7在黃瓜基因組中的同源基因序列為參考，設計特異引物，擴增獲得CsSPL7同源基因全長cDNA序列。結果成功擴增出1條約1 700 bp的單一條帶，測序結果表明，擴增片段長度為1 746 bp，編碼582個氨基酸（圖1）。對其進行Blast分析表明，其與擬南芥SPL7基因的序列相似性為43%（圖2）。

[FK（W+135mm][TPDYL1.tif]

2.2黃瓜CsSPL7基因的組織表達分析

以β-actin作為內參標定，以經不同銅濃度處理的黃瓜津研4號葉片為材料，以黃瓜CsSPL7基因cDNA全長序列為模板設計特異引物，利用QRT-PCR對CsSPL7進行表達特征分析。結果表明，CsSPL7在缺銅處理的黃瓜葉片中的相對表達量最高，而隨著銅處理濃度的增加，其表達量則逐漸下降（圖3），證明CsSPL7是1個受缺銅誘導表達的基因。

3討論

本研究通過生物信息學分析和同源克隆技術，從黃瓜葉片中克隆得到植物缺銅核心調控因子SPL7的同源基因CsSPL7，并對其序列和表達進行分析。結果表明，CsSPL7是1個缺銅誘導表達基因。人們發現從萊茵衣藻銅反應調控轉錄因子CRR1啟動子區鑒定出來的GTAC核心調控元件只是在植物Cu-microRNAs和FeSOD基因啟動子中被頻繁檢測到，暗示其在缺銅脅迫下的銅動態平衡調控過程中可能發揮重要作用[2]。缺銅脅迫信號通過擬南芥GTAC調控元件激活了miR398b、miR398c的轉錄活性，而位于185～182 bp或者 157～154 bp的GTAC核心調控元件足以調控缺銅脅迫[9]。后續結果表明，擬南芥轉錄因子基因SPL7與萊茵衣藻CRR1具有高度同源性[11]。進一步分析表明，SPL7是植物缺銅脅迫下的1個保守的核心調控因子。SPL7能夠直接與miR398啟動子區GATC調控元件結合[9]，即使是在低銅條件下，啟動子區擁有GTAC調控元件的植物銅動態平衡相關Cu-microRNAs在spl7突變體中也均不能正常表達。上述有關植物吸收和積累銅機制研究，為深入研究黃瓜CsSPL7基因的生理與分子機制鑒定了重要基礎。

相對于模式植物擬南芥的研究[9]，目前黃瓜耐銅脅迫相關基因分子調控機制的研究尚處在起步階段，而對黃瓜耐銅脅迫相關基因的分子機制的研究還較少。隨著黃瓜及各種園藝作物基因組測序的完成，結合生物信息學分析，加快了不同種間同源基因的克隆，如以擬南芥相關基因信息來克隆黃瓜中的同源基因。本研究即依托黃瓜基因組序列信息，利用生物信息學分析，在較短時間內獲得黃瓜CsSPL7的全長序列。因此，黃瓜基因組測序實施的完成，在很大程度上促進了黃瓜耐銅相關基因分子調控機制方面的研究。

雖然植物SPL7家族中的一些基因已有廣泛研究，但有一些問題仍然沒有解決。例如，除了轉運和信號轉導以外，植物SPL7家族（例如CsSPL7等）是否還有其他功能？以及作為一種微量元素，同時又作為一種調節信號，黃瓜缺銅信號如何調控黃瓜植株的生長和發育？由于這些相關分子機制還不清楚，在接下來的工作中，筆者將通過功能互補試驗、基因敲除試驗等對CsSPL7的功能進行研究，同時計劃對其啟動子序列進行克隆與分析，以期能夠幫助人們理解黃瓜耐缺銅脅迫的生理與分子機制。

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