甘薯及其近緣野生種三淺裂野牽牛（Ipmoea trifida）原生質體融合的初步研究

李麗++李云

摘要：利用酶解法從貴州省甘薯地方品種興義薯和二倍體近緣野生種三淺裂野牽牛（I.trifida）的無菌試管苗幼嫩葉柄中分離得到大量原生質體。用聚乙二醇（PEG）融合法融合這2個品種的原生質體，將融合原生質體培養在含有0.05 mg/L 2，4-D和 0.5 mg/L KT的改良MS培養基中。結果表明，3～5 d后融合原生質體發生第1次細胞分裂；培養12周后，形成直徑達1～2 mm的小愈傷組織。將這些小愈傷組織轉移到含有0.05 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT的MS培養基上，使愈傷組織增殖。

關鍵詞：甘薯；三淺裂野牽牛（I.trifida）；原生質體；PEG融合法

中圖分類號： S531.01文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0094-02

收稿日期：2015-11-04

基金項目：現代農業產業技術體系建設專項資金（編號：CARS-11-C-24）；貴州省農業科學院研究生科研創新基金（編號：黔農科合[創新基金]2012008）。

作者簡介：李麗（1982—），女，貴州銅仁人，碩士，副研究員，從事甘薯生物技術育種研究。E-mail：ilovelily317@163.com。

通信作者：李云，碩士，研究員，從事甘薯育種研究。E-mail：814480795@qq.com。

貴州省甘薯地方品種較少，且產量低、易感病，制約著貴州甘薯產業的發展。因此，為了豐富貴州省甘薯資源，改良甘薯品質特性，須將地方品種與具有優異基因的野生種進行雜交，從而創造特異的甘薯新材料。而甘薯常規育種一般采用有性雜交和自然芽變的方法進行系統選擇，這些方法具有一定的局限性。近年發展起來的原生質體融合技術，對甘薯品種改良和育種具有重要意義。通過原生質體融合，不同種類的原生質體不經過有性階段，在一定條件下融合創造雜種，能克服甘薯雜交不親和性，創造甘薯種間雜種。國內外原生質體融合技術在甘薯上的應用已取得很大進展，不僅獲得了甘薯融合原生質，而且培育出雜種植株。Sihachakr等首次獲得了甘薯原生質的再生植株體系，改良了甘薯品質[1]。Belarmino等用電融合法融合甘薯和三淺裂野牽牛（Ipmoea trifida）（四倍體）的原生質體，獲得1株再生植株[2]。Liu等用聚乙二醇（PEG）融合法獲得甘薯和I.triloba及I.lacunosa的融合原生質體，獲得少量再生植株[3-7]。Zhang等獲得了甘薯品種栗子香和I. lacunosa的種間體細胞雜種植株[8]。Guo等獲得了甘薯品種徐薯18和I. cairica的46株種間體細胞雜種植株[9]。Yang等獲得徐薯18與I. triloba的體細胞雜種植株，并從中篩選出具有膨大塊根的抗旱雜種植株[10]。王晶珊等利用PEG融合方法，獲得甘薯（I. batatas）B不親和群內品種Koganesengan和Bitambi的45株原生質體再生植株[11]。但是，目前貴州省尚未有此方面的報道。因此，本研究以甘薯二倍體近緣野生種三淺裂野牽牛（I.trifida）與貴州省地方品種興義薯為材料，對其原生質體融合進行研究，對于豐富貴州省甘薯種質資源、改善甘薯品質都具有一定的意義。

1材料與方法

1.1植物材料

供試材料為貴州省甘薯地方品種興義薯和二倍體近緣野生種三淺裂野牽牛（I.trifida）。用其無菌試管苗的幼嫩葉柄分離原生質體。

1.2葉柄原生質體分離和融合

根據Liu等的培養方法[3-7]，利用酶解法從貴州省甘薯地方品種興義薯和I.trifida的葉柄分離得到大量原生質體。在融合處理之前，用W5液[125.0 mmol/L CaCl2·2H2O、154.0 mmol/L NaCl、5.0 mmol/L KCl、5.0 mmol/L葡萄糖、5.0 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（MES），pH值為5.6]于 2 000 r/min、4 min離心洗滌1次后，收集原生質體，懸浮于W5液中，使其密度約為 106個/mL。以體積比2 ∶[KG-*3]1混合興義薯和野生種I.trifida的原生質體懸浮液，將原生質體混合液滴于培養皿底部，在其上滴加PEG融合液[30.0% PEG 6000、0.1 mol/L Ca（NO2）2·4 H2O、0.5 mol/L甘露醇，pH值為9.0]，處理10 min。融合處理后，將融合原生質體用W5液洗1次，再用培養基洗2次后進行培養。

1.3融合原生質體培養和愈傷組織的形成

根據Liu等的培養方法[3-7]，將融合原生質體培養在含有0.05 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT的改良MS培養基中，用Parafilm將培養皿密封，將融合原生質體放在27 ℃、黑暗條件下靜置培養。4周后，將培養基的甘露醇濃度降低到 0.3 mol/L，蔗糖濃度增至2.0%，其余成分不變。培養8周后，將形成的小愈傷組織轉入到含有0.05 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L KT和3.0%蔗糖的MS培養基中，在上述條件下繼續培養。12周后形成直徑1.0～2.0 mm的小愈傷組織，并將其轉移到添加0.05 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT的固體培養基上，在（27±1） ℃、黑暗條件下培養，使愈傷組織增殖。

2結果與分析

2.1原生質體分離和融合

由圖1可知，利用酶解法從貴州省甘薯地方品種興義薯和近緣野生種（I.trifida）無菌苗的幼嫩葉柄中分離得到大量原生質體，呈球形，大小不一，不易看到細胞核。在PEG融合液的作用下，2個親本的原生質體迅速發生融合。在倒置顯微鏡下觀察可見，原生質體既有二重融合、多重融合，也有未融合的單個原生質體。

2.2融合原生質體培養及愈傷組織形成

由圖2可知，將分離得到的原生質體培養于改良的MS液體培養基中，3～5 d內觀察到首次細胞分裂。由圖3可見，培養4周后，細胞分裂形成細胞團。將融合原生質體懸浮于液體培養基中，于27 ℃黑暗培養12周后，由圖4可見，細胞團形成直徑為1.0～2.0 mm的白色松脆愈傷組織，將其轉移到添加0.05 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT的固體培養基上，在27 ℃黑暗條件下培養，可使愈傷組織增殖。

3討論與結論

本研究利用與Liu等[3-7]相似的培養體系，愈傷組織形成慢，雜種植株再生率低，這與前人報道[1，3-7]一致，其主要原因是葉柄作為分離原生質體的材料不理想。劉慶昌等建立了甘薯胚性細胞懸浮培養系，能在短時間內獲得大齡再分化能力高的胚性懸浮細胞[12]。張冰玉等利用甘薯品種栗子香的胚性懸浮細胞原生質體獲得與I.triloba葉柄原生質體的融合產物，獲得了大量種間體細胞雜種植株[13]。王晶珊等利用甘薯品種Bitambi的胚性愈傷組織原生質體實現了高頻率的植株再生[11]。甘薯本身是再分化比較困難的植物[7，11]，整個培養過程太長，一般達半年以上，過長的培養周期也會降低細胞的分化能力。如果原生質體數量過少或者活力較差，也會影響彼此間的融合。所以甘薯及其近緣野生種的原生質體融合需要大量有活力的甘薯品種及近緣野生種的原生質體，而且還需要適合融合原生質體植株再生的培養體系。因此，在下一步試驗中，筆者將利用甘薯胚性懸浮細胞進行原生質體分離、培養與融合，優化原生質體雜種植株再生體系，以便獲得大量愈傷組織，實現種間體細胞雜種植株的有效再生。

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