北海道黃楊葉片離體培養及其細胞耐鹽性

孫寧++王赫++陳小強++李鳳

摘要：以北海道黃楊葉片為材料進行愈傷組織誘導及細胞增殖培養試驗，同時開展不同濃度NaCl脅迫下愈傷組織培養，探討外源激素對葉片離體培養的影響及其愈傷組織的耐鹽性。結果表明，北海道黃楊葉片誘導愈傷組織最適培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.3 g/L，有利于愈傷組織增殖的激素為2，4-D 0.5 mg/L；0.2% NaCl脅迫對愈傷組織生長影響較小，NaCl濃度高于0.4%時，隨鹽濃度升高愈傷組織脯氨酸含量增加，生長量急劇降低。

關鍵詞：北海道黃楊；愈傷組織；激素；鹽脅迫

中圖分類號：S792.119.04文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0096-02

收稿日期：2015-10-20

基金項目：天津市高等學校創新團隊（編號：TD12-5017）；國家級大學生創業訓練計劃（編號：201410061114）；天津市學院精品課程建設（植物細胞工程）。

作者簡介：孫寧（1979—），女，河北承德人，碩士，高級實驗師，從事生物技術方面的研究與教學。E-mail：sning79@sina.com。

北海道黃楊（Euonymus japonicus L.）是衛矛科衛矛屬的常綠闊葉喬木，它具有極強的耐寒性，能耐-23.9 ℃低溫[1]。北海道黃楊具有樹體高大挺拔、四季常青、冬天有紅果可供觀賞等特點，同時還有較強的凈化空氣的效果，適合作為綠化美化環境樹種[2]。

我國鹽堿地總面積約3 460萬hm2以上，耕地鹽堿化760萬hm2，大約20%的土地發生鹽堿化[3]。我國鹽堿地主要分布在東北、華北的農產區，特別是經濟比較發達的沿海城市和生態環境比較脆弱的西北內陸區域。要改變這些鹽堿地區溫帶城市中落葉樹種比較單調的模式，發展多層次的城市綠化，需要多種四季常青、環境污染小的耐鹽樹種。

[JP2]通過植物組織培養技術篩選培育耐鹽性相對比較高的植物品種是提高鹽堿地的利用率、減少土地浪費的有效解決方法之一。目前，國內外對北海道黃楊的離體培養已有部分研究，但大多集中在離體快繁方面，而利用愈傷組織培養來開展抗性育種研究極少。開展北海道的離體葉片愈傷組織培養及離體細胞鹽脅迫研究，可為篩選北海道黃楊耐鹽細胞系及抗鹽突變株的選育奠定基礎，并可為植物抗鹽育種研究提供理論支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

以完整無受損病蟲的北海道黃楊新生葉片為試驗材料。

1.2試驗方法

1.2.1外植體消毒將葉片用流水沖洗30 min，無菌條件下在75%乙醇中浸泡30 s后，用無菌水沖洗3次，再用0.1%氯化汞浸泡6 min，后用無菌水清洗4～5次。將葉片放置于無菌濾紙上吸干水分，剪為1 cm2左右帶葉脈的方形葉塊，葉背向下平鋪接種于不同配方的培養基上。

1.2.2初代培養試驗基本培養基采用MS（蔗糖30 g/L、瓊脂6.3 g/L，pH值5.8左右），附加不同濃度的6-BA、NAA、2，4-D，共設10個處理。培養溫度25 ℃，光照強度1 200～1 500 lx，光照時間12～14 h/d。接種后每隔7 d觀察統計1次誘導率。

1.2.3愈傷組織增殖培養無菌條件下將葉片四周長出的愈傷組織切下，用刀片壓碎至小顆粒狀，均勻接入到繼代增殖培養基中。基本培養基采用MS（蔗糖30 g/L、瓊脂6.3 g/L，pH值為5.8左右），附加不同濃度的NAA、2，4-D，共設6個處理。培養溫度25 ℃，暗培養。接種后每隔7 d觀察1次愈傷組織變化。

1.2.4愈傷組織鹽脅迫培養將增殖培養獲得的愈傷組織稱重記錄后，按“2.2.3”節方法均勻接種到含不同濃度的NaCl的培養基中。基本培養基采用“2.2.3”節所篩選優化的配方，NaCl濃度設置0（CK）、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、10%，培養條件同上。接種后每隔7 d觀察1次北海道黃楊愈傷組織在NaCl脅迫下的生長情況，測定游離脯氨酸含量。

2結果與分析

2.1不同激素濃度對葉片愈傷組織誘導的影響

葉片接種30 d后由愈傷組織誘導情況見表1。從表1可以看出，A2處理愈傷組織誘導率高達82.3%，但誘導愈傷組織量很小；而A8、A10處理誘導率相對較高，均為80%，且愈傷組織的形成量也較多；A7處理誘導率相對較低，為59%，但誘導形成的單塊愈傷組織體積較大。

將未誘導出愈傷組織、誘導出少量愈傷組織和誘導出少量愈傷組織且褐化的3種葉片再次轉接入A8、A10處理中進行培養。經過10 d后，原本未誘導出愈傷組織的葉片四周開始長出黃白色的愈傷組織，質地疏松為顆粒狀；而原有少量愈傷組織的葉片四周也開始繼續增殖愈傷組織，同樣為黃白色，質地疏松；誘導出愈傷組織但愈傷組織褐化的葉片，能夠在本已褐化了的組織周圍長出新的淺黃色半透明狀愈傷組織，其質地柔軟疏松。

2.2不同激素濃度對愈傷組織增殖的影響

將葉片誘導獲得的愈傷組織接入6種增殖培養基中，14 d 后愈傷組織呈黃白色、質地堅硬的小塊狀。用濃度為 0.5 mg/L 2，4-D的培養基對愈傷組織的增殖效果最好，其次為添加2，4-D 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L的處理，增殖效果也比較好，愈傷組織增殖量較多；而濃度為0.2 mg/L 2，4-D、NAA的處理雖然都對愈傷組織有增殖效果，但是增殖的速度非常慢，且增殖量非常少（表2）。同時發現在接種20 d后，所有愈傷組織都開始出現褐化，且增殖速度越快、增殖量越多愈傷組織出現褐化現象的時間越早，并且褐化程度也越嚴重；此時的愈傷組織顏色為褐色，質地變軟，不再呈堅硬的小塊狀。接種30 d后，全部愈傷組織褐化。因此繼代增殖轉接周期以18～20 d為宜。

2.3NaCl脅迫對愈傷組織的影響

2.3.1NaCl脅迫對愈傷組織生長的影響

2.3.1.1愈傷組織在不同濃度NaCl脅迫下的形態特征

將增殖培養獲得的愈傷組織接入含NaCl培養基中，14 d后，愈傷組織發生輕微的褐化現象，且隨著培養時間的延長褐化現象逐漸嚴重。其中處理1、處理2仍有部分愈傷組織可保持增殖生長，而處理3-處理6的愈傷組織生長量隨著NaCl濃度的逐漸升高而減少，并且出現較為嚴重的褐化現象。培養20 d的愈傷組織生長狀況見圖1。從圖1可以看出，生長量均隨著NaCl濃度增大而減小，同時褐化現象越來越明顯。

[FK（W9][TPSN1.tif；S+2mm]

2.3.1.2NaCl脅迫對愈傷組織生長量的影響

愈傷組織在6個NaCl濃度處理下培[JP3]養20 d左右，取出愈傷組織進行稱量，并與愈傷組織接種前鮮質量取差值，計算出這段時間內不同濃度NaCl脅迫下北海道黃楊愈傷組織鮮質量增長量的平均值。從圖2可以看出，在NaCl脅迫下，北海道黃楊愈傷組織的鮮質量增長量均呈下降趨勢，當NaCl濃度達0.2%時，愈傷組織鮮質量增長量與對照相比降低18.69%；當NaCl濃度增大到04%，增長量與對照相比降低58.72%，愈傷組織增長量明顯減少，且褐化情況也比較嚴重。表明0.2% NaCl對北海道黃楊愈傷組織生長影響較小，NaCl含量大于0.4%時對其生長起到了明顯的抑制作用。

2.3.2NaCl脅迫下愈傷組織游離脯氨酸含量的變化

植物在正常狀態下，其體內脯氨酸含量比較低而且較為平穩，當植

[FK（W10][TPSN2.tif]

物遇到干旱、鹽堿等逆境時，其體內脯氨酸含量會急劇上升，而且其脯氨酸積累指數與植物的抗逆性有關，因此，游離脯氨酸含量常作為植物抗逆性檢測的生理指標之一。

不同濃度NaCl脅迫下，北海道黃楊愈傷組織中游離脯氨酸的含量見圖3。北海道黃楊愈傷組織中游離脯氨酸的含量隨鹽濃度升高呈現先比較平緩后急劇上升趨勢，在無鹽及低濃度鹽脅迫的情況下，愈傷組織內的游離脯氨酸含量均較低，隨著培養基中NaCl濃度升高，脯氨酸含量變化呈急劇上升趨勢，在鹽濃度相對較高（1.0%）時游離輔基酸含量最高，達184.2 μg/g。

3討論

在誘導葉片愈傷組織階段，2，4-D 1.5 mg/L、6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L這2個激素配比對愈傷組織的誘導效果最好，誘導率最高。在試驗中發現在葉片培養前期誘導出愈傷組織量很低的葉片，在轉移到6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培養基中進行2次培養后，會促進葉片四周切口處愈傷組織的形成，誘導出愈傷組織厚度為1.0～1.5 cm。在愈傷組織增殖培養中，愈傷組織增殖生長啟動時間比較晚，15 d左右開始啟動，而在30 d時出現褐化現象；0.5 mg/L 2，4-D對愈傷組織增殖效果最好。

在加入不同濃度NaCl的培養基中進行愈傷組織培養，NaCl濃度為0.2%時愈傷組織長勢沒有受到太大影響，當NaCl含量上升到0.4%以上時，愈傷組織生長量出現明顯的下降趨勢，褐化現象逐漸嚴重，游離脯氨酸含量增加。因此，在后續研究中可選用大于0.4%的濃度作為耐鹽細胞的誘變與篩選的NaCl濃度。

[HS2*2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

[1]王新生. 北海道黃楊的特性和用途[J]. 中國林業，2008（10）：44.

[2]王瑞云，王玉國. 北海道黃楊試管快速繁殖技術研究[J]. 生物技術，2004，14（2）：51-53.

[3]周和平，張立新，禹鋒，等.我國鹽堿地改良技術綜述及展望[J]. 現代農業科技，2007（11）：159-161，164.