內生真菌對連作花生土壤尖孢鐮刀菌的拮抗作用

劉貴友 鄒瑤 顧楊霞 戴傳超

摘要：在實驗室條件下研究3種內生真菌對連作花生土壤尖孢鐮刀菌的拮抗作用。結果表明：擬莖點霉NJ4.1菌株、擬莖點霉B3菌株和角擔子菌B6菌株對花生根腐病病原菌尖孢鐮刀菌均有拮抗作用，其中擬莖點霉NJ4.1菌株對尖孢鐮刀菌抑制作用明顯，抑菌率為38.93%，與尖孢鐮刀菌生態位重疊指數為1/3；擬莖點霉NJ4.1菌株生長過程中產生的揮發物對尖孢鐮刀菌抑菌率為18.15%，擬莖點霉NJ4.1菌株發酵液對尖孢鐮刀菌也有一定的抑制作用，但明顯小于揮發物對尖孢鐮刀菌的影響。

關鍵詞：內生真菌；花生根腐病；尖孢鐮刀菌；拮抗作用；生態位重疊指數

中圖分類號： S435.652文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0171-04

收稿日期：2015-10-27

基金項目：國家自然科學基金（編號：31370507）；江蘇省教育廳產業化推進項目（編號：JHB2012-16）。

作者簡介：劉貴友（1973—），男，江蘇南京人，博士，副教授，研究方向為微生物轉化和微生物生態學。E-mail：liuguiyou2001@163.com。

通信作者：戴傳超，博士，教授，研究方向為微生物生態學和土壤生態與修復。E-mail：daichuanchao@njnu.edu.cn。

花生是世界上分布較廣泛的作物，世界六大洲都有種植。花生是我國重要的油料、經濟作物，2013年我國花生種植面積463萬hm2，花生總產量1 697萬t，因此可見，我國是世界上花生總產量和花生油總產量最大的國家[1]。近年來，我國大豆產業受到國外沖擊，花生行業的穩定及可持續發展對食用油安全有著重要意義。因土地資源有限，產區相對集中，很多地方已經形成傳統的優勢花生種植產業，農民常常連片、大規模種植，有的甚至已連作10～20年，往往導致花生根腐病、白絹病等真菌病害加劇[2]，莢果產量下降，生產成本增加[3]。

花生根腐病俗稱“鼠尾”、爛根，它是由包括尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）在內的鐮刀菌屬引起的。最新研究表明，隨著花生連續種植，尖孢鐮刀菌的相對豐度顯著增加，連作花生根腐病發病率提高2倍[4]，是限制連作花生生產的關鍵因素。病原真菌侵染不僅引起花生減產，而且還會影響花生品質[5]。目前，克服病原真菌引起的花生減產、質量下降的方法主要是使用大量有機肥和藥劑等，這不僅增加生產成本，還會引起環境污染，危害人體健康等。生物防治是一種對環境友好、對病害具有潛在應用價值的綜合治理方法。

研究表明，一些來源于病害植株的根際微生物可以對病菌形成拮抗作用[6]。外源施加哈茨木霉（Trichoderma harzianum）可以誘導黃瓜發生防御反應，產生可降解病菌細胞壁的相關酶[7]，顯著防治黃瓜枯萎病[8-9]。從花生根際土壤中篩選得到側孢短芽孢桿菌，對峙試驗表明，側孢短芽孢桿菌對花生根腐病、白絹病、瘡痂病、葉斑病等病原菌有顯著的抑制作用，盆栽和田間試驗表明，該菌對花生根腐病、白絹病等均有明顯的防治效果[10]。

研究發現，植物內生真菌施加到土壤環境中不僅可以促進植物生長[11-13]，而且可以誘導植物幼苗提高防御能力[14-17]，減少病害發生[18]，但是內生真菌的抗病機制不是非常清楚。本研究主要探討實驗室條件下內生真菌與花生常見病害——根腐病病原菌之間的拮抗機制，以期為花生根腐病的生物防治提供一定理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株內生真菌：擬莖點霉屬真菌（Phomopsis sp.）NJ4.1，分離自菊科茅蒼術（Rhizoma areactylodis Lanceae）葉片[12]；角擔子菌屬真菌（Ceratobasidum stevensii）B6，分離自大戟科重陽木（Bischofia polycarpa）莖內皮；擬莖點霉屬真菌（Phomopsis liquidambari）菌株B3，分離自大戟科重陽木莖內皮[19]。花生病原真菌：尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum，簡稱Fo）。供試菌株均為南京師范大學江蘇省功能微生物與功能基因組學重點實驗室保藏菌株。

1.1.2培養基PDA培養基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，加水至1 L；PDB培養液：配方（不加瓊脂）與PDA相同；單一碳/氮源培養基[20]：碳/氮源10 mmol/L，瓊脂15 g，加水至1 L。內生真菌發酵液培養基：無菌發酵液10 mL，PDA培養基90 mL。

1.2內生真菌與病原菌平板對峙培養[21]

內生真菌和花生病原菌分別接入PDB培養液中，28 ℃、180 r/min振蕩培養4 d。轉接至PDA培養基平板，28 ℃培養5 d。在PDA培養基上活化的菌落邊緣打取5 mm菌塊，轉接至新鮮PDA培養基平板上，內生真菌與病原菌之間距離 4 cm，28 ℃培養5 d，分別觀察2種菌生長情況。在新鮮PDA培養基平板上接5 mm空白PDA培養基和5 mm病原菌菌塊作為對照。按下式計算抑菌率：

抑菌率=（對照組菌落半徑-試驗組菌落半徑）/對照組菌落半徑×100%[22]。

1.3內生真菌與病原菌營養利用相似性

將內生真菌和花生病原菌分別接入PDB培養液中，28 ℃、180 r/min振蕩培養4 d活化。將活化的內生真菌和病原菌分別接種到含唯一碳/氮源的瓊脂平板上，本試驗共有16種單一碳/氮源培養基（碳/氮源：果糖，葡萄糖，棉子糖，木糖，海藻糖，組氨酸，D-密二糖，丙氨酸，絲氨酸，精氨酸，蔗糖，苯丙氨酸，脯氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸）。用直徑為5 mm的打孔器分別在母菌平板上打孔，得到均勻內生真菌和病原真菌，接種到每一種碳/氮源培養基的中心。對照組為接種在不含任何碳/氮源的瓊脂平板上的內生真菌和病原真菌[23]。28 ℃培養5 d，觀察內生真菌與病原真菌的生長情況。生態位重疊指數計算公式：

生態位重疊指數=2種菌共同利用的碳氮源數量/測試菌利用的碳氮源數量[24]。

1.4內生真菌的發酵液對病原菌生長的影響

將內生真菌接種到PDB培養液中，28 ℃培養14～15 d，[JP2]5 000 r/min 離心10 min，收集上清液。上清液經3層濾紙抽濾，除去菌絲體。濾液通過0.22 μm濾膜，得到無菌發酵原液。

無菌發酵原液用無菌水稀釋，得到一系列不同濃度梯度（稀釋5、2倍，原液）的發酵液，以1 ∶[KG-*3]9的體積比與PDA培養基混合，充分搖勻，制成平板。將5 mm病原真菌菌塊接種在平板中心，28 ℃培養5 d，測量菌落半徑（cm）。以不加發酵液，僅加1/10體積無菌水的PDA作為對照。按“1.2”節公式計算抑菌率。

1.5內生真菌揮發物對病原菌生長的影響

在2個PDA平板中分別接種3個內生真菌菌塊和1個病原真菌菌塊。將2個平板的皿口相扣，用封口膜封好。培養病原真菌的平板放在上面，28 ℃恒溫培養5 d。以接種病原真菌而未接種內生真菌的菌塊作為對照。按“1.2”節公式計算抑菌率。

2結果與分析

2.1內生真菌與病原菌平板對峙培養結果

[JP2]從圖1-a可見，尖孢鐮刀菌的菌落呈深色（圖1-a），肉眼觀察呈紫色。從圖1-b可見，NJ4.1菌落包圍尖孢鐮刀菌菌落，尖孢鐮刀菌不再生長，NJ4.1也不再生長，對峙處有較為明顯的隔離帶（抑菌圈）。B6菌株與尖孢鐮刀菌的對峙處也有較為明顯的隔離帶（圖1-c）。內生真菌B3菌落呈淺色（圖[JP3]1-d），肉眼觀察呈淡黃色，對尖孢鐮刀菌的抑制作用較為明顯。

由表1可見，對峙培養中3種內生真菌對尖孢鐮刀菌均有不同程度的抑制，其中內生真菌NJ4.1菌株對尖孢鐮刀菌抑制作用較為明顯，抑菌率達到38.93%。

2.2擬莖點霉NJ4.1菌株與尖孢鐮刀菌營養利用相似性

由表2可見，平板上內生真菌NJ4.1菌株與尖孢鐮刀菌相互抑制的部分原因是兩者之間營養利用具有相似性。在同一平板上生長時，內生真菌NJ4.1菌株與尖孢鐮刀菌發生了營養利用競爭，引起了抑制作用，內生真菌NJ4.1菌株與病原菌尖孢鐮刀菌的生態位重疊指數為1/3。

2.3內生真菌NJ4.1菌株發酵液對尖孢鐮刀菌生長的影響

由圖2可見，與對照組相比，不同濃度的發酵液對尖孢鐮刀菌有不同程度的抑制作用。

2.4內生真菌NJ4.1的揮發物對尖孢鐮刀菌生長的影響

與對照組（圖3-a）相比，NJ4.1揮發物對病原真菌尖孢鐮刀菌的抑制作用明顯（圖3-b）。測定結果表明，對照組、試驗組菌落半徑分別為（2.76±0.10）、（2.26±0.14） cm。NJ4.1揮發物對尖孢鐮刀菌的抑菌率為18.12%。

3結論與討論

[JP2]研究發現，在土壤中施加廣譜植物內生真菌擬莖點霉B3菌株，可以顯著加快連作土壤中植物凋落物中纖維素、木質素降解和植物殘茬的腐解，協同土中G-細菌加速酚酸降解，減少化感物質的自毒作用，誘導植物幼苗提高防御能力[14-17]；此外，可以有效改變土壤微生物區系，改善土壤酶活性，改良土壤環境，提高花生產量[11-13]，克服花生連作障礙。施加到土壤環境中的擬莖點霉NJ4.1、擬莖點霉B3和角擔子菌B6不僅可以促進植物生長，而且可以增強植物防御系統，減少病害發生，但是抗病機制尚未清楚，因此揭示土壤中施加內生真菌抵御花生病害的抗病機制，對于克服花生連作障礙具有重要意義。

植物內生菌與病原菌具有相同的生態位，在植物體內相互競爭空間、營養。內生真菌為占據有效生態位，通過產生次級代謝產物和一些抗菌成分，強烈抑制病原菌生長，使病原菌得不到正常的營養供給而消亡，從而增強宿主抵御病害的能力[25]。分離自茅蒼術內生熒光假單胞菌ALEB 7B，能夠顯著抑制羅耳阿太菌菌株SY4的生長，并且能夠顯著降低茅蒼術組培苗白絹病的發病率[26]。近年來，關于內生真菌擬莖點霉屬次級代謝產物領域的研究倍受關注。分離自蒲公英擬莖點霉PG23的菌株培養濾液含有抗菌化合物2-羥基-6-甲基苯酸，對一些病原菌顯示出拮抗作用，體外培養表現出強烈的抑菌活性[27]。分離自箭葉菊（Senecio kleiniiformis）擬莖點霉No.7133，它合成的4種次生代謝產物也表現出不同的抑菌活性[28]。但是由于擬莖點霉屬在種級水平的鑒定存在實際困難，一些能在體外發揮作用的次級代謝產物功效目前尚不清楚[29-30]。實驗室條件下，綠色木霉TR28菌株與尖孢鐮刀菌平板對峙結果表明，綠色木霉生長快于尖孢鐮刀菌FO2G1，接觸后FO2G1生長停止[31]。生防菌JK-2（短短芽孢桿菌，Brevibacillus brevis） 對尖孢鐮刀菌效果特別顯著[32]。

本研究表明，內生真菌NJ4.1、B3和B6菌株對尖孢鐮刀菌均有明顯拮抗作用，其中NJ4.1菌株對尖孢鐮刀菌抑制作用最為明顯，抑菌率達到38.93%。進一步研究發現，NJ4.1菌株和尖孢鐮刀菌生態位重疊指數為1/3，NJ4.1菌株生長過程中產生的揮發物對尖孢鐮刀菌的抑菌率為18.15%，NJ4.1菌株發酵液對尖孢鐮刀菌也有一定的抑制作用。

如何鑒定出NJ4.1菌株的揮發物和發酵液中的次生代謝產物以及內生真菌如何在自然環境下抑制病菌生長，促進花生植株抵御病菌侵染，減少花生患病概率，提高花生產量，均有待進一步探討。

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