牛源性大腸桿菌乳腺炎模型大鼠與血清白細胞介素18的相關性

王軍 石冬梅++王哲

摘要：通過檢測乳腺炎大鼠模型的血清白細胞介素18（IL-18）水平，探討IL-18與乳腺炎的相關性。構建大鼠乳腺炎模型，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定血清中的IL-18濃度。結果表明，大鼠乳腺炎與血清IL-18水平密切相關，乳腺炎組的血清IL-18水平明顯高于對照組（P<0.01），隨著乳腺炎發病程度的加重，血清IL-18水平顯著升高（P<0.01）。乳腺炎血清IL-18水平較正常顯著升高，乳腺炎越嚴重則血清IL-18濃度越高，血清IL-18濃度可能為乳腺炎的診斷和預測提供依據。

關鍵詞：大腸桿菌；大鼠；乳腺炎；白細胞介素18（IL-18）；相關性

中圖分類號： S857.2+6文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0292-02

收稿日期：2015-11-03

基金項目：河南省高等學校重點科研項目（編號：15A230015）；河南省重點科技攻關項目（編號：82102130014）。

作者簡介：王軍（1977—），男，內蒙古呼和浩特人，博士研究生，講師，主要從事獸醫臨床教學及奶牛疾病研究。E-mail：iamwangjun1977wj@163.com。

通信作者：王哲，教授，博士生導師，主要從事動物營養代謝病及中毒病研究。E-mail：wang_zhe@jlu.edu.cn。

奶牛乳房炎是世界范圍內最常見的奶牛疾病，其中臨床型乳房炎常伴隨嚴重的炎癥和疼痛，嚴重影響感染動物的健康和福利。奶牛乳房炎會導致巨大的經濟損失，主要包括產奶量降低、棄乳、奶牛淘汰、優化、治療費用等。據報道，奶牛乳房炎引起的經濟損失中，約70%是由產奶量降低引起的，在泌乳期間，奶牛1個乳頭感染會導致產奶量下降 10%～20%。不同養殖場因其地理位置、飼養管理模式、統計方式不同，其經濟損失的程度也有所不同。荷蘭平均每頭奶牛每年因奶牛乳房炎造成的經濟損失為198歐元，某些養殖場的經濟損失可達400歐元[1]；美國每頭奶牛因奶牛乳房炎造成的經濟損失達到185美元。目前，對于奶牛乳腺炎的研究已取得很多成果，但仍未完全解決生產中由乳腺炎引發的諸多問題；因此，全面而深入地研究奶牛乳腺炎的發病機理和診斷方法，有助于奶牛養殖業的發展和消費者的食品安全。

白細胞介素18（IL-18）是一種作用強大[2-3]的脂肪組織的前炎性細胞因子，可引起組織細胞的局部炎癥，促進細胞凋亡和死亡，在炎癥反應和免疫應答方面起著至關重要的作用[4-5]。大多數研究表明，IL-18對于動物機體增強免疫、抵抗病原微生物感染、抑制病毒活性等方面具有非常重要的作用[4-5]，在某些疾病的臨床診斷中具有廣泛的應用前景。通過建立乳腺炎大鼠模型，檢測細胞因子IL-18的表達水平，初步探討IL-18與乳腺炎的相關性，以期為乳腺炎的臨床診斷提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

致病性大腸桿菌自奶牛乳汁中分離，鑒定后保存備用。

1.1.2供試大鼠

試驗動物為產后10～14 d的SD大鼠，體質量為（278.50）g。將56只母鼠隨機分為6個試驗組和1個對照組。

1.1.3儀器與試劑

營養肉湯培養基、瓊脂培養基、血瓊脂培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司。高壓蒸汽滅菌器，電子天平（梅特勒），超凈工作臺（上海值歐凈化科技有限公司），YM100Z型立式壓力蒸汽滅菌器，微量注射器，臺式高速離心機，CX22LED型顯微鏡（奧林巴斯），IL-18試劑盒等。

1.2方法

1.2.1菌液的配制

大腸桿菌從河南省鄭州市患有乳腺炎的奶牛乳汁中分離，在肉湯培養基中培養純化，然后配成大腸桿菌菌液，加入30%的滅菌甘油，于-80 ℃下冷凍保存。使用前解凍接種肉湯培養基，純化并采用平板計數法進行細菌計數。按照梯度稀釋法，采用滅菌生理鹽水將細菌配成濃度為2×104、2×105、2×106、2×107、2×108、2×109 CFU/mL的細菌懸液，于4 ℃下保存備用。

1.2.2接種大鼠

將分娩后10～14 d的母鼠隨機分為A組（2×104 CFU/mL）、B組（2×105 CFU/mL）、C組（2×106 CFU/mL）、D組（2×107 CFU/mL）、E組（2×108 CFU/mL）、F組（2×109 CFU/mL）。擠奶后，分別取0.5 mL上述不同濃度的大腸桿菌懸液，采用微量注射器在第4乳區對稱注入乳房，對照組注射等量的滅菌生理鹽水，注射后輕揉。

1.2.3樣品的采集

分別于注射菌液后6、12 h及1、2、3、5、7 d觀察臨床癥狀并進行乙醚吸入麻醉，每次各組取1只大鼠，靜脈采血進行血常規檢查和分離血清，解剖摘取大鼠的脾臟和胸腺，稱質量并計算脾臟和胸腺指數。采用ELISA方法檢測IL-18，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計分析軟件對試驗數據進行統計分析。計量數據采用t檢驗，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結果與分析

2.1大鼠乳腺炎模型的臨床癥狀和生理指標

注射菌液6 h后，D、E、F組部分大鼠出現精神沉郁、飲食減少；12 h后，部分大鼠乳房局部溫度升高，剖檢可見乳腺腫脹和充血；12～24 h D組大鼠死亡1只，F組大鼠死亡3只，通過解剖發現，此階段攻毒組大鼠的臨床癥狀最為明顯；48 h后癥狀逐漸減輕。本試驗中未感染的大鼠共2只，均為A組。根據乳腺組織中細菌數量的檢測和計算，A組的注射細菌數量為輕度乳腺炎（<2×105 CFU/mL），B、C、D組為中度乳腺炎（2×105～2×108 CFU/mL），E、F組為重度乳腺炎（>2×108 CFU/mL）。建立牛源性大腸桿菌乳腺炎大鼠模型，注射細菌的數量應控制在2×105～2×107 CFU/mL。

2.2牛源性大腸桿菌乳腺炎大鼠模型血清IL-18水平的表達

由表1可知，牛源性大腸桿菌乳腺炎與血清IL-18水平密切相關，乳腺炎組大鼠的血清IL-18水平明顯高于對照組，且差異極顯著（P<0.01）。隨著乳腺炎發病程度的不同，血清IL-18水平表達也不同，重度乳腺炎的血清IL-18水平顯著高于輕度乳腺炎，且差異極顯著（P<0.01）。注射大腸桿菌的時間不同，血清IL-18水平表達也不同，48 h的血清IL-18水平升至最高，之后逐漸下降，但沒有統計學意義（P>0.05）。

3結論與討論

3.1大鼠乳腺炎模型的構建

腸桿菌性乳腺炎的致病微生物包括埃希氏大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、腸桿菌等，均為環境因素導致乳房炎的典型案例。感染來源于牛糞及污染的環境，牛舍過度潮濕、泥濘使腸桿菌大量持久地在環境中生存，易造成腸桿菌性乳房炎發生。

乳腺炎模型的構建最早起源于1970年，之后很多學者采用不同方法建立乳腺炎模型，以研究其發病機理和機制。鐘凱等通過乳頭注射金黃色葡萄球菌誘導建立大鼠乳腺炎模型；姚雪萍等建立了家兔乳腺炎模型；孫勇采用LPS誘發的乳腺炎建立了小鼠模型[2]。本試驗從奶牛乳腺炎病例中檢測出致病性大腸桿菌，通過培養和鑒定，將其以不同劑量接種于分娩10～14 d的大鼠。結果表明，建立大腸桿菌乳腺炎大鼠模型的注射細菌應控制在2×105～2×107 CFU/mL。本研究成功建立了牛源性大腸桿菌乳腺炎模型，為臨床上大腸桿菌引起乳腺炎的預防和治療提供依據。

3.2大鼠乳腺炎模型臨床指標的變化

經乳頭管向大鼠乳頭內注射不同數量的牛源性大腸桿菌，均可引起乳腺的感染，但在不同注射數量和時間下大鼠的臨床指標表現不同。注射大腸桿菌后，部分大鼠出現精神沉郁、飲食減少、體溫顯著升高的現象，于12 h后解剖大鼠，可見部分大鼠的乳腺組織出現充血紅腫、變硬。通過解剖和臨床癥狀觀察可知，注射牛源性大腸桿菌的菌數為2×105～2×107 CFU/mL時，均可引起乳腺組織不同程度的炎癥，且不同時間下炎癥的程度不同。

3.3牛源性大腸桿菌乳腺炎大鼠模型的血清IL-18水平動態變化

[JP2]IL-18是一種新發現的細胞因子，在機體免疫調控中起著至關重要的作用，可刺激淋巴細胞產生TNF-α和IFN-γ，促使機體免疫力增強，在抗炎、抗菌、抗腫瘤方面發揮重要作用[8-9]。馬露等通過豬脾淋巴細胞增殖試驗和抗病毒活性檢測發現，IL-18能有效抑制病毒的增殖[10]。張書起等以 IL-18作為疫苗佐劑，可明顯增強小鼠的免疫力[11-12]。金元昌等對不同馬立克氏病抗性的雞進行攻毒后檢測，結果表明，雞 IL-18 基因的表達與馬立克氏病抗性遺傳性狀相關[4-5]。關于乳腺炎IL-18水平相關性的研究國內報道很少。本試驗對牛源性大腸桿菌大鼠乳腺炎模型的血清IL-18水平進行動態檢測，結果表明，牛源性大腸桿菌乳腺炎與血清IL-18水平具有密切的相關性。乳腺炎組的血清IL-18水平明顯高于對照組，且差異極顯著（P<0.01），隨著乳腺炎炎癥程度的加重，血清IL-18水平表達明顯升高，且差異極顯著（P<0.01）。本試驗為乳腺炎發病機理和抗病性的進一步研究提供了依據，并為IL-18的深入研究和應用提供了參考。

[HS2*2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

[1]余光濤. 大鼠乳腺金黃色葡萄球菌急性感染相關炎性細胞因子變化規律的研究[D]. 揚州：揚州大學，2014.

[2]孫勇. 梔子苷對LPS誘發的小鼠乳腺炎性損傷保護效果的研究[D]. 長春：吉林大學，2014.

[3]付明哲，李長安，魏揀選，等. 陜西奶牛隱性乳腺炎病原菌的自動鑒定和耐藥性分析[J]. 中國獸醫雜志，2014，50（9）：38-41.

[HT8.]

[4]金元昌，李玉峰，張艷. 不同馬立克氏病抗性雞攻毒后IL-18基因的差異表達[J]. 中國獸醫學報，2015，35（3）：355-357.

[5]馬全英，祝秀梅，安芳蘭. 白細胞介素18研究進展[J]. 貴州畜牧獸醫，2014，38（2）：21-24.

[6]鐘凱，王艷玲，鄒思湘，等. 乳頭管灌注內毒素誘發大鼠實驗性乳腺炎模型的建立[J]. 農業生物技術學報，2005，13（5）：654-658.

[7]姚雪萍，楊德英，楊洪森，等. 乳頭管灌注金黃色葡萄球菌對家兔血清中酶活性的影響[J]. 中國畜牧獸醫，2010，37（2）：59-61.

[8]Reinhardt T A，Sacco R E，Nonnecke B J，et al. Bovine milk proteome：quantitative changes in normal milk exosomes，milk fat globule membranes and whey proteomes resulting from Staphylococcus aureusmastitis[J]. Journal of Proteomics，2013，82：141-154.

[9]劉娟，姚天佑，孔鶯鶯，等. NAD+抑制脂多糖誘導海馬炎癥因子的表達[J]. 揚州大學學報：農業與生命科學版，2016，37（1）：16-21.

[10][JP3]馬露，喬薪瑗，唐麗杰，等. 豬IL-18在乳酸乳球菌中的表達及其[JP2]生物活性的檢測[J]. 生物工程學報，2014，30（10）：1541-1548.

[11]張書起，于洪川，張春良，等. 大鼠試驗性乳房炎病理模型[J]. 農業科學研究，2006，27（4）：27-31.

[12]李靜杰. 哈爾濱周邊地區奶牛隱性乳腺炎的流行病學調查[J]. 養殖技術顧問，2015（1）：58.