牛源性大腸桿菌乳腺炎模型大鼠與血清白細(xì)胞介素18的相關(guān)性

王軍 石冬梅++王哲

摘要：通過檢測(cè)乳腺炎大鼠模型的血清白細(xì)胞介素18（IL-18）水平，探討IL-18與乳腺炎的相關(guān)性。構(gòu)建大鼠乳腺炎模型，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定血清中的IL-18濃度。結(jié)果表明，大鼠乳腺炎與血清IL-18水平密切相關(guān)，乳腺炎組的血清IL-18水平明顯高于對(duì)照組（P<0.01），隨著乳腺炎發(fā)病程度的加重，血清IL-18水平顯著升高（P<0.01）。乳腺炎血清IL-18水平較正常顯著升高，乳腺炎越嚴(yán)重則血清IL-18濃度越高，血清IL-18濃度可能為乳腺炎的診斷和預(yù)測(cè)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；大鼠；乳腺炎；白細(xì)胞介素18（IL-18）；相關(guān)性

中圖分類號(hào)： S857.2+6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0292-02

收稿日期：2015-11-03

基金項(xiàng)目：河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（編號(hào)：15A230015）；河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：82102130014）。

作者簡(jiǎn)介：王軍（1977—），男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，博士研究生，講師，主要從事獸醫(yī)臨床教學(xué)及奶牛疾病研究。E-mail：iamwangjun1977wj@163.com。

通信作者：王哲，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病及中毒病研究。E-mail：wang_zhe@jlu.edu.cn。

奶牛乳房炎是世界范圍內(nèi)最常見的奶牛疾病，其中臨床型乳房炎常伴隨嚴(yán)重的炎癥和疼痛，嚴(yán)重影響感染動(dòng)物的健康和福利。奶牛乳房炎會(huì)導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，主要包括產(chǎn)奶量降低、棄乳、奶牛淘汰、優(yōu)化、治療費(fèi)用等。據(jù)報(bào)道，奶牛乳房炎引起的經(jīng)濟(jì)損失中，約70%是由產(chǎn)奶量降低引起的，在泌乳期間，奶牛1個(gè)乳頭感染會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降 10%～20%。不同養(yǎng)殖場(chǎng)因其地理位置、飼養(yǎng)管理模式、統(tǒng)計(jì)方式不同，其經(jīng)濟(jì)損失的程度也有所不同。荷蘭平均每頭奶牛每年因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失為198歐元，某些養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)400歐元[1]；美國(guó)每頭奶牛因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到185美元。目前，對(duì)于奶牛乳腺炎的研究已取得很多成果，但仍未完全解決生產(chǎn)中由乳腺炎引發(fā)的諸多問題；因此，全面而深入地研究奶牛乳腺炎的發(fā)病機(jī)理和診斷方法，有助于奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和消費(fèi)者的食品安全。

白細(xì)胞介素18（IL-18）是一種作用強(qiáng)大[2-3]的脂肪組織的前炎性細(xì)胞因子，可引起組織細(xì)胞的局部炎癥，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和死亡，在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答方面起著至關(guān)重要的作用[4-5]。大多數(shù)研究表明，IL-18對(duì)于動(dòng)物機(jī)體增強(qiáng)免疫、抵抗病原微生物感染、抑制病毒活性等方面具有非常重要的作用[4-5]，在某些疾病的臨床診斷中具有廣泛的應(yīng)用前景。通過建立乳腺炎大鼠模型，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-18的表達(dá)水平，初步探討IL-18與乳腺炎的相關(guān)性，以期為乳腺炎的臨床診斷提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

致病性大腸桿菌自奶牛乳汁中分離，鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2供試大鼠

試驗(yàn)動(dòng)物為產(chǎn)后10～14 d的SD大鼠，體質(zhì)量為（278.50）g。將56只母鼠隨機(jī)分為6個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。

1.1.3儀器與試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。高壓蒸汽滅菌器，電子天平（梅特勒），超凈工作臺(tái)（上海值歐凈化科技有限公司），YM100Z型立式壓力蒸汽滅菌器，微量注射器，臺(tái)式高速離心機(jī)，CX22LED型顯微鏡（奧林巴斯），IL-18試劑盒等。

1.2方法

1.2.1菌液的配制

大腸桿菌從河南省鄭州市患有乳腺炎的奶牛乳汁中分離，在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)純化，然后配成大腸桿菌菌液，加入30%的滅菌甘油，于-80 ℃下冷凍保存。使用前解凍接種肉湯培養(yǎng)基，純化并采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。按照梯度稀釋法，采用滅菌生理鹽水將細(xì)菌配成濃度為2×104、2×105、2×106、2×107、2×108、2×109 CFU/mL的細(xì)菌懸液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2接種大鼠

將分娩后10～14 d的母鼠隨機(jī)分為A組（2×104 CFU/mL）、B組（2×105 CFU/mL）、C組（2×106 CFU/mL）、D組（2×107 CFU/mL）、E組（2×108 CFU/mL）、F組（2×109 CFU/mL）。擠奶后，分別取0.5 mL上述不同濃度的大腸桿菌懸液，采用微量注射器在第4乳區(qū)對(duì)稱注入乳房，對(duì)照組注射等量的滅菌生理鹽水，注射后輕揉。

1.2.3樣品的采集

分別于注射菌液后6、12 h及1、2、3、5、7 d觀察臨床癥狀并進(jìn)行乙醚吸入麻醉，每次各組取1只大鼠，靜脈采血進(jìn)行血常規(guī)檢查和分離血清，解剖摘取大鼠的脾臟和胸腺，稱質(zhì)量并計(jì)算脾臟和胸腺指數(shù)。采用ELISA方法檢測(cè)IL-18，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1大鼠乳腺炎模型的臨床癥狀和生理指標(biāo)

注射菌液6 h后，D、E、F組部分大鼠出現(xiàn)精神沉郁、飲食減少；12 h后，部分大鼠乳房局部溫度升高，剖檢可見乳腺腫脹和充血；12～24 h D組大鼠死亡1只，F(xiàn)組大鼠死亡3只，通過解剖發(fā)現(xiàn)，此階段攻毒組大鼠的臨床癥狀最為明顯；48 h后癥狀逐漸減輕。本試驗(yàn)中未感染的大鼠共2只，均為A組。根據(jù)乳腺組織中細(xì)菌數(shù)量的檢測(cè)和計(jì)算，A組的注射細(xì)菌數(shù)量為輕度乳腺炎（<2×105 CFU/mL），B、C、D組為中度乳腺炎（2×105～2×108 CFU/mL），E、F組為重度乳腺炎（>2×108 CFU/mL）。建立牛源性大腸桿菌乳腺炎大鼠模型，注射細(xì)菌的數(shù)量應(yīng)控制在2×105～2×107 CFU/mL。

2.2牛源性大腸桿菌乳腺炎大鼠模型血清IL-18水平的表達(dá)

由表1可知，牛源性大腸桿菌乳腺炎與血清IL-18水平密切相關(guān)，乳腺炎組大鼠的血清IL-18水平明顯高于對(duì)照組，且差異極顯著（P<0.01）。隨著乳腺炎發(fā)病程度的不同，血清IL-18水平表達(dá)也不同，重度乳腺炎的血清IL-18水平顯著高于輕度乳腺炎，且差異極顯著（P<0.01）。注射大腸桿菌的時(shí)間不同，血清IL-18水平表達(dá)也不同，48 h的血清IL-18水平升至最高，之后逐漸下降，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

3.1大鼠乳腺炎模型的構(gòu)建

腸桿菌性乳腺炎的致病微生物包括埃希氏大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、腸桿菌等，均為環(huán)境因素導(dǎo)致乳房炎的典型案例。感染來源于牛糞及污染的環(huán)境，牛舍過度潮濕、泥濘使腸桿菌大量持久地在環(huán)境中生存，易造成腸桿菌性乳房炎發(fā)生。

乳腺炎模型的構(gòu)建最早起源于1970年，之后很多學(xué)者采用不同方法建立乳腺炎模型，以研究其發(fā)病機(jī)理和機(jī)制。鐘凱等通過乳頭注射金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)建立大鼠乳腺炎模型；姚雪萍等建立了家兔乳腺炎模型；孫勇采用LPS誘發(fā)的乳腺炎建立了小鼠模型[2]。本試驗(yàn)從奶牛乳腺炎病例中檢測(cè)出致病性大腸桿菌，通過培養(yǎng)和鑒定，將其以不同劑量接種于分娩10～14 d的大鼠。結(jié)果表明，建立大腸桿菌乳腺炎大鼠模型的注射細(xì)菌應(yīng)控制在2×105～2×107 CFU/mL。本研究成功建立了牛源性大腸桿菌乳腺炎模型，為臨床上大腸桿菌引起乳腺炎的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

3.2大鼠乳腺炎模型臨床指標(biāo)的變化

經(jīng)乳頭管向大鼠乳頭內(nèi)注射不同數(shù)量的牛源性大腸桿菌，均可引起乳腺的感染，但在不同注射數(shù)量和時(shí)間下大鼠的臨床指標(biāo)表現(xiàn)不同。注射大腸桿菌后，部分大鼠出現(xiàn)精神沉郁、飲食減少、體溫顯著升高的現(xiàn)象，于12 h后解剖大鼠，可見部分大鼠的乳腺組織出現(xiàn)充血紅腫、變硬。通過解剖和臨床癥狀觀察可知，注射牛源性大腸桿菌的菌數(shù)為2×105～2×107 CFU/mL時(shí)，均可引起乳腺組織不同程度的炎癥，且不同時(shí)間下炎癥的程度不同。

3.3牛源性大腸桿菌乳腺炎大鼠模型的血清IL-18水平動(dòng)態(tài)變化

[JP2]IL-18是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，可刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IFN-γ，促使機(jī)體免疫力增強(qiáng)，在抗炎、抗菌、抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用[8-9]。馬露等通過豬脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和抗病毒活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-18能有效抑制病毒的增殖[10]。張書起等以 IL-18作為疫苗佐劑，可明顯增強(qiáng)小鼠的免疫力[11-12]。金元昌等對(duì)不同馬立克氏病抗性的雞進(jìn)行攻毒后檢測(cè)，結(jié)果表明，雞 IL-18 基因的表達(dá)與馬立克氏病抗性遺傳性狀相關(guān)[4-5]。關(guān)于乳腺炎IL-18水平相關(guān)性的研究國(guó)內(nèi)報(bào)道很少。本試驗(yàn)對(duì)牛源性大腸桿菌大鼠乳腺炎模型的血清IL-18水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，結(jié)果表明，牛源性大腸桿菌乳腺炎與血清IL-18水平具有密切的相關(guān)性。乳腺炎組的血清IL-18水平明顯高于對(duì)照組，且差異極顯著（P<0.01），隨著乳腺炎炎癥程度的加重，血清IL-18水平表達(dá)明顯升高，且差異極顯著（P<0.01）。本試驗(yàn)為乳腺炎發(fā)病機(jī)理和抗病性的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)，并為IL-18的深入研究和應(yīng)用提供了參考。

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