海洋酸化背景下鉛脅迫對近江牡蠣溶菌酶活性的影響

李曉梅++郭體環++張來軍++李由明

摘要：為探討在未來海洋酸化背景下重金屬對貝類免疫的影響，在實驗室條件下設置0.05、0.50、5.00 mg/L 3種硝酸鉛質量濃度，以0 mg/L作為對照，比較正常海水（pH值8.0）與酸化海水（pH值7.6）條件下鉛脅迫對近江牡蠣鰓組織溶菌酶含量的影響。結果表明，低pH值高鉛質量濃度組[pH值7.6，Pb（NO3）2質量濃度5.00 mg/L]的鰓組織溶菌酶含量隨時間的延長直線下降，其余各試驗組的鰓組織溶菌酶含量總體呈先下降、后上升、再下降的變化趨勢。至30 d時，對照組[pH值8.0，Pb（NO3）2質量濃度0.00 mg/L]的溶菌酶含量顯著高于其他組（P<0.05），而低pH值高鉛質量濃度組顯著低于其他組（P<0.05），酸化組的近江牡蠣鰓組織溶菌酶含量均低于正常海水組，差異顯著（P<0.05）。在2種pH值條件下，近江牡蠣鰓組織溶菌酶含量均隨硝酸鉛質量濃度的增加而降低。研究表明，近江牡蠣長時間暴露于低pH值、鉛脅迫或低pH值與鉛脅迫共存的環境下，均導致其鰓組織溶菌酶含量降低、免疫力下降；海洋酸化和鉛對近江牡蠣具有聯合毒性效應。

關鍵詞：海洋酸化；鉛；鰓；溶菌酶；近江牡蠣

中圖分類號： X55文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0297-03

收稿日期：2015-10-28

基金項目：[JP2]國家自然科學基金（編號：31260139）；海南省自然科學基金（編號：314086）；海南省教育廳高?？蒲许椖浚ň幪枺篐jkj2013-39）。

作者簡介：李曉梅（1975—），女，碩士，副教授，主要從事海洋生物學研究。E-mail：xiaomeili1215@sina.com。

溶菌酶（lysozyme）別稱N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，是一種小分子量的堿性蛋白水解酶，參與機體內多種免疫反應，在機體正常防御和非特異免疫中具有重要作用，是生物體內重要的非特異性免疫因子，常作為評價機體免疫水平的重要指標之一[1-2]。

重金屬是一類典型的環境污染物。環境中重金屬污染的來源主要是化工、采礦、金屬冶煉及加工、電鍍、輪船制造等行業，以及農用殺蟲劑、生活污水、垃圾滲出液等。對于生物體而言，重金屬包括必需金屬和非必需金屬。鉛（lead，Pb）屬于非必需金屬，不參與有機體的代謝活動，組織內含有較低濃度時便對有機體產生顯著的毒性[3-4]。

近年來，隨著我國工業的發展，工業廢棄物的排放隨之增加，重金屬污染越來越嚴重，嚴重危害著包括人類在內的各種生命體的健康與生存。在所有已知重金屬毒性物質中，由鉛引起的污染和危害事件數量較多，從而備受關注。生物體即使攝入極少量的鉛，也會造成極大損害。

海洋酸化已被廣泛確認為CO2濃度上升導致的又一重大環境問題[5]?；剂系氖褂玫热祟惢顒訉е麓髿庵蠧O2濃度不斷升高，可能已經導致了全球變暖和氣候異常等[6]，海洋不斷從大氣中吸收CO2，對緩解全球變暖起著重要作用[7]。然而，自工業革命以來，海洋大量吸收人類排放的CO2，已導致上層海水的pH值下降了0.1[8]。根據IPCC預測模型（A1F1）的推測，至2100年大氣CO2濃度將升高至800～1 000 μL/L，表層海水pH值將下降0.3～0.4，這種酸化速度在過去3億年間的任何時期均未曾有過[9]。海洋酸化引起的海洋化學變化（碳酸鹽系統及物質形態）正在改變海洋生物賴以生存的化學環境，海洋生物的代謝過程會受到影響，海洋生態的穩定性會發生變化[10]。海洋酸化引起的海水pH值降低會改變海洋生物的多項生理功能，使海洋生物抵抗不良環境脅迫與疾病等的能力降低，致使脅迫或疾病對海洋生物造成更嚴重的損傷，甚至在較低脅迫強度下造成生物個體死亡。另外，海洋酸化還可導致己經穩定在沉積物中的重金屬二次釋放。在pH值呈堿性和中性的條件下，重金屬溶解很少，但在pH值為6的處理條件下，6～18 d期間鎘的釋放量為4～13 μg/L，19～21 d期間達到40～50 μg/L；19～21 d 期間鉛的釋放量達到100～370 μg/L；鋅的釋放量最高可達160 μg/L[11]。

近江牡蠣（Crassostrea rivularis Gould）是我國主要的牡蠣養殖品種之一，隸屬于軟體動物門（Mollusca）瓣鰓綱（Lamellibranchia）珍珠貝目（Pterioida）牡蠣科（Ostridae），屬于半咸水種類，主要分布于我國華南沿海眾多的河口地帶。由于近江牡蠣生活在河口區域，不斷有淡水經此流入海洋，再加上潮汐、海浪等的影響，近江牡蠣的生活環境經常發生劇烈變化；而且，近江牡蠣固定在巖石或其他物體上生活，不像其他海洋生物可以移動和趨利避害，從而使近江牡蠣自身形成了一系列應對環境脅迫的適應機制，因此近江牡蠣是用于研究環境脅迫響應的良好材料。

目前，有關海洋酸化和鉛對貝類生物學影響的研究多為單一因素的影響，包括海洋酸化對貝類受精、發育、免疫、攝食、繁殖的影響[12-14]，以及鉛對貝類免疫的影響[15]等，很少有研究關于鉛和海洋酸化共存的復合脅迫對貝類的影響。本試驗通過研究海水酸化和鉛雙重脅迫對近江牡蠣溶菌酶活性的影響，為近江牡蠣的健康養殖、棲息地環境檢測、防治污染、海洋環境保護等提供依據。

1材料與方法

1.1材料

供試近江牡蠣于2015年3月購自海南省昌江縣昌化鎮，采捕后立即送至試驗場地，洗刷干凈后置于4.0 m×4.0 m×1.5 m的室內水泥池暫養7 d。經測定，近江牡蠣采集地和試驗地海水中的鉛含量均小于0.01 mg/L，無顯著性差異（P>0.05）。暫養期間采用靜態換水法，每天換水1次。養殖用水為過濾海水，主要水環境因子按采樣地調控，水溫（27±1）℃、pH值8.0、鹽度3%，以金藻和青島大扁藻作為餌料，24 h 連續充氧。暫養結束后，死亡率<1%，符合試驗要求，挑選大小均勻的近江牡蠣個體作為受試動物，其質量為（1036±1.83） g/只。

本試驗所用硝酸鉛為分析純，購自恒興化工。使用硝酸鉛作為污染物，將其配制成10 mg/mL的母液，按需要稀釋至相應質量濃度來進行鉛脅迫試驗。

1.2海水處理

試驗前，采用醋酸調配pH值為7.6的酸化海水。為防止酸化海水在使用過程中pH值升高，經反復試驗，最終采用輸液管勻速緩慢地向試驗容器中滴加醋酸以穩定水體pH值。以pH值為8.0的正常海水作為對照。

1.3試驗分組

中華人民共和國國家標準（UCD 551463）海水水質標準（GB 3097—1997）四類海水、農業部無公害食品海水養殖用水水質標準（NY 5052—2001）中均規定鉛含量≤0.05 mg/L，本試驗以此為依據，按等比數列分別設立0.05、0.50、5.00 mg/L 3個硝酸鉛質量濃度組，以0 mg/L作為對照組，每組均設置3個平行。各試驗組海水的pH值及硝酸鉛質量濃度見表1。試驗在150 L的塑料桶中進行，每桶加入100 L試驗溶液，每組放入50只經暫養的近江牡蠣。試驗期間每24 h更換1次試驗溶液，以金藻和青島大扁藻作為餌料，將條件控制在水溫（27±1）℃、鹽度3%，24 h連續充氧。

1.4樣品制備

試驗開始的當天記為0 d，分別于試驗開始后5、10、15、20、25、30 d從各桶隨機取3只近江牡蠣，每組9只。取鰓組織并稱質量，按1 g ∶[KG-*3]9 mL比例添加預冷的生理鹽水，冰上勻漿，于4 ℃、5 000 r/min下離心10 min，取上清液，置于 -80 ℃ 超低溫冰箱保存備用。

1.5溶菌酶活性的測定

采用A050型溶菌酶檢測試劑盒（南京建成生物工程研究[CM（25]所研制）測定溶菌酶活性，按照試劑盒使用說明書進行操作，每個待測樣品測試3次。

1.6數據分析

試驗數據以“平均值±標準誤”表示。采用Excel、SPSS等軟件進行單因素方差分析并制作圖表。

2結果與分析

由圖1、表2可知，在pH值相同的情況下，5、15、25、30 d時近江牡蠣的鰓組織溶菌酶含量均隨硝酸鉛質量濃度的增加而降低；10 d時溶菌酶含量隨硝酸鉛質量濃度的增加而先降后升。20 d時不同pH值條件下，溶菌酶含量隨硝酸鉛質量濃度的變化趨勢出現較大差異，pH值為8.0時，各組溶菌酶含量無顯著差異（P>0.05）；pH值為7.6時，溶菌酶含量隨硝酸鉛質量濃度增加先升后降，相鄰各組間差異顯著（P<005），0.00 mg/L與0.50 mg/L間差異不顯著（P>0.05）。

各處理間差異隨時間的延長而增大，5 d時僅組2、組4與組5間存在顯著性差異（P<0.05），其余各組均無顯著差異（P>0.05）；隨著時間的延長，存在顯著差異的組越來越多，30 d時差異達到最大。

由圖1可知，對照組（組1）鰓組織溶菌酶含量在整個試驗過程中穩定在（79.02±3.91）g/L（P>0.05），至30 d時對照組溶菌酶含量顯著高于其他組（P<0.05），表明近江牡蠣長時間暴露在低pH值、鉛脅迫或低pH值與鉛脅迫共存的環境下均會使鰓組織溶菌酶基因的表達受到抑制，導致溶菌酶含量降低。組8的鰓組織溶菌酶含量自20 d開始隨時間的延長幾乎呈直線下降趨勢，至30 d時溶菌酶含量顯著低于其他組（P<0.05），表明低pH值與高質量濃度鉛（5.00 mg/L）共同脅迫時，近江牡蠣鰓組織溶菌酶的表達受到明顯抑制。其余各試驗組的鰓組織溶菌酶含量總體呈先下降、后上升、再下降的變化趨勢，表明低刺激強度下近江牡蠣在一定時期內具有一定代謝適應能力。

[JP2]由圖2可知，30 d時在各硝酸鉛質量濃度下，酸化組近江牡蠣的鰓組織溶菌酶含量均低于正常pH值組，硝酸鉛質量濃度分別為0.00、0.50、5.00 mg/L時差異顯著（P<0.05），0.05 mg/L時差異不顯著（P>0.05）；在2種pH值條件下，近江牡蠣鰓組織溶菌酶含量均隨硝酸鉛質量濃度的增加而降低。

[TPLXM2.tif]

3結論與討論

McHenery等以30種貝類為研究對象，在其消化腺、外套膜、鰓、肌肉中均能檢測到溶菌酶活性[16]。本研究中，所有處理組的近江牡蠣鰓中均能檢測到較高含量的溶菌酶，而溶菌酶是生物體內重要的非特異免疫因子之一，在機體免疫過程中不僅能催化水解細菌細胞壁而導致細菌溶解死亡，還可誘導調節其他免疫因子的合成與分泌[2]。可見，包括近江牡蠣在內，貝類的鰓在防止病原微生物入侵方面起著重要作用。近江牡蠣受到pH值降低和鉛脅迫后，鰓組織溶菌酶含量呈先下降、后上升、再下降的趨勢。近江牡蠣在遭遇外界脅迫時，代謝受到抑制，溶菌酶含量降低；而后由于適應性代謝加強，溶菌酶含量逐漸上升，甚至超過原有水平；隨著時間的延長，脅迫依然沒有解除，長時間的環境刺激超出近江牡蠣的適應范圍，導致溶菌酶含量逐漸降低，免疫力下降。在養殖生產過程中，應盡量避免養殖水體pH值過低、鉛含量過高，一旦發現應及時調整，以保證近江牡蠣的免疫力維持在正常水平，減少病害的發生。

本研究表明，海洋酸化使近江牡蠣鰓中的溶菌酶含量降低，免疫力下降。Bibby等研究表明，海洋酸化對貝類的免疫系統具有很大影響；他們認為可能的原因是pH值降低使 CaCO3 難以沉積，導致體內Ca2+水平升高，Ca2+濃度的改變影響細胞的信號通路，進而影響其新陳代謝和功能[17]。這只是一種可能性推斷，還需通過分子生物學等手段進一步驗證。目前，海洋酸化對貝類免疫功能影響的研究相對較少，其影響的生理生化及分子機制等尚待進一步研究。

試驗結果表明，pH值為8.0時，各硝酸鉛濃度組溶菌酶含量的變化幅度小于pH值為7.6時，即酸化條件下，鉛對近江牡蠣鰓組織溶菌酶含量的影響大于正常pH值條件時。當pH值為7.6時，Pb（NO3）2 5.00 mg/L組的鰓組織溶菌酶含量隨時間的延長幾乎呈直線下降趨勢，至30 d時溶菌酶含量顯著低于其他組（P<0.05）?？梢?，酸化可加強鉛對近江牡蠣的毒性效應，同時，鉛也可增強酸化對近江牡蠣的毒性效應，二者具有聯合毒性效應。

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