HPLC—MS/MS法測定鴨肉中氯霉素類藥物殘留

陳曉蘭 陳未 王帥兵 蔣春茂

摘要：現(xiàn)有動物性食品中氯霉素類藥物殘留檢測前處理方法較為復雜，為簡化樣品分析方法，建立簡單的樣品前處理方法和HPLC-MS/MS方法，以同時檢測鴨肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留。以50%乙腈制備組織勻漿液，向勻漿液中添加對照藥物后采用乙腈去蛋白，高速離心，選擇0.1%乙酸和乙腈-甲醇（1 ∶[KG-*3]1）為流動相，以 0.5 mL/min 流速梯度洗脫，LC-MS/MS電噴霧電源（ESI），負離子，選擇多反應監(jiān)測（MRM）模式檢測，并對所建立的方法進行方法學驗證。在所建立的樣品前處理和色譜條件下，3種目標化合物在3 min內(nèi)實現(xiàn)同時分離，標準工作曲線在 0.025～5.000 μg/g范圍內(nèi)線性良好，r2為0.995 8～0.997 6。最低檢測限均為2.5 ng/g，最低定量限為 25 ng/g。在添加量為20、50、100 ng/g的水平下，平均回收率為93.26%～97.25%，RSD為0.47%～1.83%。本試驗采用較為簡單的乙腈蛋白沉淀法，操作簡易，過程提取回收率高，可大幅提高樣品前處理的效率，在所建立的色譜條件下檢測靈敏度大幅提高。該方法簡易可行，能滿足國際氯霉素類藥物殘留檢測的要求。

關(guān)鍵詞：HPLC-MS/MS；氯霉素；甲砜霉素；氟苯尼考；鴨肉；殘留

中圖分類號： TS207.5文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0316-04

[HJ1.3mm]

收稿日期：2015-11-16

基金項目：江蘇省泰州市社會發(fā)展項目（編號：TS032）。

作者簡介：陳曉蘭（1979—），女，江蘇海安人，博士，講師，主要從事新藥研究。E-mail：cxl7972563@163.com。

通信作者：蔣春茂，博士，教授，主要從事新獸藥研究。E-mail：cmj109@126.com。

動物源食品（肉、蛋、奶、水產(chǎn)及其制品）的安全是全世界關(guān)注的焦點，其中獸藥殘留問題是影響動物源食品安全的重要因素之一[1]。氯霉素類藥物屬于廣譜抗生素，對革蘭氏陰性及陽性細菌均有抑制作用，主要包括氯霉素（chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）、氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）等。氯霉素可抑制人類骨髓的造血功能，引起再生障礙性貧血，在美國、歐盟及我國均被禁用于食品動物，同時規(guī)定了禽肉中甲砜霉素、氟苯尼考的最高殘留限量分別為50、100 ng/g。目前，氯霉素類藥物殘留的檢測方法主要有微生物法[2]、酶聯(lián)免疫法[3]、共振生物傳感器法[4]、氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、超高效液相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、液相色譜-質(zhì)譜法[9]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]等。

目前，動物性食品中氯霉素類及其代謝物的殘留檢測前處理方法較為傳統(tǒng)，藥物與雜質(zhì)間分離度差，且復雜的前處理程序影響了樣品回收率。如何簡化前處理方法是目前該類藥物檢測中亟待解決的關(guān)鍵問題。僅采用HPLC技術(shù)或GC技術(shù)已無法滿足多殘留檢測的要求，且其在鴨肉殘留檢測方法中的應用尚未見國內(nèi)外報道。鑒于此，本研究擬將快速溶劑萃取（ASE）技術(shù)應用于樣品前處理，采用HPLC-MS/MS法建立快速、簡易、高靈敏、高通量的禽肉中氯霉素類及其代謝物的多殘留快速檢測技術(shù)，為獸藥殘留監(jiān)控體系的建立和完善提供先進的技術(shù)資料，對于我國動物性食品出口貿(mào)易更好地與國際接軌、保障人類健康具有重要意義。

1材料與方法

1.1藥物與試劑

氯霉素對照品購自中國食品藥品檢定研究所，批號為130555-201203。甲砜霉素對照品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號為k0240706。氟苯尼考對照品購自中國獸醫(yī)藥品[JP2]監(jiān)察所，批號為k0301305。7-羥基雙香豆素標準品購自Sigma-Aldrich公司，批號為STBD2336V。氯霉素原料藥購自鄭州津北化工有限公司。甲砜霉素粉（5%）、氟苯尼考粉（10%）均購自江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司。乙腈為色譜純，購自Fisher scientific公司。二甲基亞砜（DMSO）為色譜純，購自國藥集團化學試劑有限公司。乙酸為色譜純，購自Sigma-Aldrich公司。

1.2儀器與設(shè)備

API4000 Q-trap型三重四級桿/離子阱質(zhì)譜儀，包含電噴霧電離源（ESI源）（美國應用生物系統(tǒng)公司）；1200系列高效液相色譜系統(tǒng)（美國安捷倫科技有限公司）；CTC PAL型自動進樣器（CTC Analytics，AG，瑞士）；FA25型高速勻漿機（Fluko公司）。

1.3試驗動物及處理

雛鴨購自江蘇省海安縣某孵化場，選擇無抗飼料飼養(yǎng)至30日齡。將鴨分為2組，其中一組給以氯霉素原料藥、甲砜霉素粉、氟苯尼考粉，均按說明書劑量拌料給藥，連用3 d；另一組為對照組，不給以任何藥物。分別在給藥后3 d將其剖殺，取各組肌肉，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4試驗方法

1.4.1系列標準工作溶液的配制

精確稱取適量氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標準品，分別置于20 mL容量瓶中，采用DMSO溶解并定容，超聲促溶，充分搖勻，配制成1 mg/mL的標準儲備液。采用移液槍各取100 μL標準儲備液于700 μL乙腈中，配制成100 μg/mL的混合工作液。采用乙腈梯度稀釋至5.000、2.000、1.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.025 μg/mL 的混合系列標準工作溶液。

1.4.2內(nèi)標工作溶液的配制

精確稱取適量7-羥基雙香豆素標準品，置于10 mL容量瓶中，采用DMSO溶解并定容，超聲促溶，充分搖勻，配制成2 mg/mL的標準儲備液。采用乙腈稀釋至200 ng/mL，儲存?zhèn)溆谩?

1.4.3空白肌肉勻漿液

稱取一定量的鴨空白肌肉樣品，剪碎，加入10倍體積的50%乙腈，將樣品置于冰浴，采用高速勻漿機進行勻漿處理，得到均一的勻漿液。

1.4.4標準工作曲線的前處理

取5 μL系列標準工作液（5.000、2.000、1.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.025 μg/mL）加入至50 μL空白肌肉勻漿液中，渦旋振蕩 30 s，加入150 μL內(nèi)標工作溶液，渦旋振蕩3 min，使蛋白充分沉淀；于4 ℃、14 000 r/min條件下離心10 min，取150 μL上清液加入至150 μL超純水中，混合均勻后待進樣。標準曲線的系列濃度為2.50、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 ng/mL；肌肉勻漿為10倍體積勻漿液，因此在肌肉中的定量范圍為25.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0、2 000.0、5 000.0 ng/g。

1.4.5給藥鴨肌肉樣品前處理

取給藥鴨肌肉勻漿液 50 μL，加入5 μL乙腈，使其與空白添加樣品（標準曲線）的基質(zhì)保持一致；加入150 μL含內(nèi)標的乙腈，渦旋振蕩3 min，于4 ℃、14 000 r/min條件下離心10 min，取150 μL上清液加至150 μL超純水中，混合均勻后待進樣。

1.4.6HPLC色譜條件

采用CAPCELLPAK型色譜柱（MG，50 mm×2.0 mm，I.D. 5 μm）（日本資生堂），流動相A為01%乙酸，流動相B為乙腈-甲醇（體積比1 ∶[KG-*3]1），進樣體積為 10 μL，梯度洗脫條件見表1。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），應用負離子模式，檢測方式為多反應監(jiān)測（MRM）。質(zhì)譜離子源參數(shù)分別為CUR 40.00、CAD-2.00、IS-4 500.00、TEM 400.00、GS1 40.00、GS2 50.00、ihe ON。化合物質(zhì)譜參數(shù)見表2。采用Analyst 1.4.2質(zhì)譜采集與分析軟件。

1.4.7加標回收率

在空白鴨肉中，分別添加25、50、100 g/kg 質(zhì)量濃度水平的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考對照品，每個質(zhì)量濃度水平設(shè)3個平行試驗，計算3種物質(zhì)的加標回收率和相對標準偏差（RSD）。

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的平均分子量分別為 323.13、356.22、358.20，這3個化合物均含有2個Cl-離子。Cl在自然界中有2種同位素，即35Cl、37Cl，其分子量分別為34.969、36.966，豐度分別為75.77%、24.23%。為獲得更高的靈敏度，以含35Cl的化合物作為目標化合物進行檢測，經(jīng)計算，含35Cl的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的準確分子量分別為322、355、357。

預先配制50、100、150 ng/mL質(zhì)量濃度的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標準溶液，以流動注射的方式在負離子模式下進行一級質(zhì)譜母離子全掃描，分子離子m/z分別為320.9、353.9、355.9，其中50 ng/mL分子離子的響應在106 cps附近，即為最佳優(yōu)化質(zhì)量濃度。以50 ng/mL質(zhì)量濃度在負離子模式下進行自動優(yōu)化，以確定最高響應二級離子m/z以及相應的DP、CE、CXP參數(shù)（表2）。最終優(yōu)化ESI源的碰撞電壓、離子化溫度、氣簾氣等參數(shù)。

2.2色譜條件的優(yōu)化

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考均為弱極性化合物，極易溶解于甲醇、乙腈。本研究以含0.1%乙酸作為水相，0.1%乙酸能促進分子的電離，大幅增強檢測信號的強度；以等比例甲醇-乙腈作為有機相，隨著有機相比例的提高，目標物保留時間縮短，但分離效果較差，如果有機相比例過低，其色譜峰較寬，靈敏度將隨之降低。等度洗脫要將3個目標化合物同時分離，單個樣品的檢測時間較長，因此最終選擇梯度洗脫，可在較短時間內(nèi)將3個化合物很好地分離，同時提高了分析效率及檢測靈敏度。

2.3樣品的提取

在動物組織樣品中，氯霉素類藥物的常用提取溶劑為乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯等。本試驗采用較為簡單的乙腈蛋白沉淀法，過程提取回收率約為95%，符合要求且步驟簡單，可大幅提高樣品前處理的效率。

2.4方法的線性范圍、定量限和檢測限

標準工作曲線的處理見“1.4.4”節(jié)，進樣10 μL。在本方法所確定的試驗條件下，采用Analyst 1.4.2軟件進行數(shù)據(jù)的采集與分析。將各待測化合物和內(nèi)標峰面積的比值與理論濃度采用一元二次回歸方程（quadratic）擬合，得到權(quán)重因子為1/x2。氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表3，回歸曲線見圖1、圖2、圖3。氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的定量下限均為25 ng/g，定量下限的信噪比分別為77.2、53.5、320.4（圖4、圖5、圖6），符合信噪比（RSN）>10作為定量下限的要求。當信噪比為3時，最低檢測限分別為2.50、2.50、1.25 ng/g。

2.5加標回收率

3種藥物在20、50、100 μg/kg添加水平下的平均回收率為93.26%～97.25%，RSD為0.47%～1.83%（表4）。可見，本方法可滿足鴨肉中同時檢測氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的要求。

2.6給藥動物肌肉中藥物濃度的測定

[CM（24]給藥樣品經(jīng)處理后進樣，通過Analyst 1.4.2軟件計算，[CM）]肌肉樣品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的平均濃度分別為735、1 470、1 540 ng/g（圖7）。

3結(jié)論與討論

本研究建立了應用HPLC-MS/MS檢測禽肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留的檢測方法，采用負離子選擇反應監(jiān)測模式同時檢測3種化合物。本方法僅取0.5～1.0 g樣品，經(jīng)50%乙腈高速勻漿后，取50 μL勻漿樣品，加入5 μL乙腈，以7-羥基雙香豆素為內(nèi)標。無需脫脂和固相萃取等操作，且無需氮吹濃縮。該方法簡單易行，出峰時間為1～3 min，分析快速，且方法的最低檢測限低于國家氯霉素類殘留最低檢測限（100 ng/g）。該方法的回收率和準確率高，完全可滿足禽肉中氯霉素類藥物的殘留確證。

有關(guān)鴨肉中氯霉素類藥物殘留檢測的報道很少，但在其他有關(guān)動物組織中，氯霉素類藥物殘留檢測方法的報道很多。陶昕晨等采用HPLC-MS/MS建立蝦肉和豬肉中氯霉素類藥物的多殘留檢測方法，以2%堿性乙酸乙酯提取，其平均回收率為78.17%～99.86%，但保留時間為2.63～3.72 min[13]；本試驗的分析時間更短，僅為1～2 min，且樣品處理方法更為簡單。

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