接種AMF對煤礦廢棄物上高丹草根系生長及抗氧化酶系統的影響

高雁琳++李鈞敏++閆明

摘要：采用盆栽試驗方法，以高丹草為研究對象，選用摩西球囊霉（Glomus mosseae）和地表球囊霉（Glomus versiforme），分別研究單接種和混合接種對粉煤灰（S1）、煤矸石（S2）和粉煤灰與煤矸石混合物（S3） 3種基質上高丹草（Sorghum bicolor×S.sudanense）根系形態及抗氧化酶系統的影響，并以正常沙土（S4）作為對照。結果表明：煤礦區廢棄物基質上高丹草根系的生長受到抑制，接種AM真菌減緩了高丹草根系生長受抑制的程度，促進根長、根表面積、根體積、根生物量的顯著增加；高丹草根系SOD、POD、CAT活性顯著提高，MDA含量降低。AM真菌可通過調節高丹草根系形態，提高根系抗氧化酶活性，增強高丹草在煤礦廢棄物復合逆境中的抗逆性，并且接種摩西球囊霉對粉煤灰以及[JP2]粉煤灰和煤矸石混合基質上高丹草根系的促進作用最佳，而接種地表球囊霉更適于煤矸石基質上高丹草根系的生長。

關鍵詞：叢枝菌根真菌（AMF）；煤礦廢棄物；高丹草；根系形態；抗氧化酶

中圖分類號： X171.4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0452-05

收稿日期：2015-10-08

基金項目：國家自然科學基金（編號：30800133、31270461）；山西師范大學校基金（編號：ZR1211）。

作者簡介：高雁琳 （1988—），女，山西朔州人，碩士，主要從事菌根生態學研究。E-mail：cgsayll@126.com。

通信作者：閆明，博士，副教授，碩士生導師，主要從事植被生態學研究。E-mail：mycorrhiiza@sina.com。

煤礦開采對環境造成極大擾動，引發了一系列亟待解決的生態環境問題，如水土流失、土地貧瘠化、鹽堿化等。采煤沉陷區是煤礦廢棄地復墾的主要類型之一，其治理也是目前礦區生態修復的重大難題。充填復墾是采煤沉陷區植被重建的主要方式之一，而煤矸石和粉煤灰是目前充填復墾的主要材料[1]，然而，其具有物理結構不良、保水保肥能力差、營養元素缺乏、重金屬濃度高、鹽分含量過高、極端pH值以及微生物區系稀少且活性極低等許多不利因子[2]，可引起植物生長及其生理活性的降低，最終導致植被退化，因此，增強煤礦廢棄地植被抗逆性、提高植物成活率具有實際意義。叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）存在于幾乎所有類型的土壤中，可以與陸地上絕大部分的高等植物物種形成互惠共生體[3]，改善植物對水分和礦質營養的吸收，增強植物對高鹽度及重金屬等不利因子的耐性[4-5]，提高植物存活率，促進植物生長。

目前，煤礦區AM真菌的研究，一方面集中在對煤礦區AM真菌的調查、分類以及優勢AM真菌的篩選[6-7]，另一方面集中在通過接種AM真菌對煤礦區土壤進行改良（如土壤肥力、土壤酶活性[8-9]等）以及對植物進行修復（如促進礦質營養的吸收[10-11]和對重金屬的吸收與轉移[12]等方面）。植物根系是吸收水分和養分并進行物質轉化的重要器官，其生長發育及形態特征直接影響地上部的形態建成和物質積累，同時也是AM真菌侵染和最先感受煤礦廢棄物不利因子復合脅迫信號的部位[13]。AM真菌如何影響煤礦廢棄物在復合逆境中植物根系的形態及抗氧化酶系統，能否促進根系的生長、提高抗氧化酶的活性、增強植物的抗逆性，目前相關研究較少。因此，本研究以高丹草為試驗材料，分析了單接種和混合接種AM真菌對不同類型煤礦區廢棄物上高丹草根系形態、根系活力和抗氧化酶活性的影響，并進一步篩選出不同類型的煤礦廢棄物上高丹草接種的最適AM菌種，以期為運用菌根技術提高煤礦區植被恢復效果提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

菌種摩西球囊霉（Glomus mosseae，BGC NM01A）和地表球囊霉（Glomus versiforme，BGC GD01C），由北京市農林科學院植物與營養資源研究所提供，接種劑為以高粱為宿主植物繁殖的土沙混合物，內含被感染根段、孢子和菌絲。高丹草[Sorghum bicolor （L.） Moench×Sorghum sudanense（Piper） Stapf，晉草1號] 種子由山西省臨汾市小麥研究所提供。供試基質為煤矸石（取自山西省臨汾市煤運公司煤炭轉運站）、粉煤灰（取自山西省漳澤電力臨汾熱電公司）及土沙混合物（黃土和河沙體積比為3 ∶[KG-*3]1）。煤矸石過3 mm篩，黃土、河沙和粉煤灰過1 mm篩，經121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌2 h，取出放置1周后備用。栽培容器為棕色圓形塑料花盆（盆口直徑18 cm×盆底直徑14 cm×盆高15 cm）。

1.2試驗設計與處理

采用隨機區組設計，設定2個因素：菌根和基質。菌根有4個水平：不接種對照（CK）、接種G.mosseae（G.m）、接種G.versiforme（G.v） 以及兩者混合接種（G.mv）；基質有4個水平：粉煤灰、煤矸石、粉煤灰與煤矸石混合物（體積比為1 ∶[KG-*3]4） 以及沙土混合物（體積比為1 ∶[KG-*3]3） ，依次編號S1、S2、S3、S4，供試基質基本理化性質見表1。每個處理設4個重復，共計64盆。2014年6月2日挑選籽粒飽滿、大小均一的種子，置于10% H2O2 中表面消毒10 min，無菌水沖洗5次，置于 25 ℃ 培養箱中的濕潤紗布上催芽，種子露白即可播種。每盆裝厚度約8 cm的滅菌基質，粉煤灰、煤矸石、粉煤灰與煤矸石混合物及沙土混合物的質量分別為1 405、1 785、1 598、2 250 g，其上覆蓋滅菌沙土800 g，厚度約為3 cm，采用菌種層接法，分別稱取接種劑G.m、G.v以及2種菌劑按1 ∶[KG-*3]1比例混合均勻后的接種劑各120 g，將60 g菌劑均勻撒施在土壤表面，放入已催芽的種子20粒，在其上覆蓋60 g菌劑，再覆蓋沙土220 g，厚度約為1 cm。不接種處理采用相同方法加入120 g的滅菌菌劑。

1.3測定參數和方法

2014年8月31日收苗，將整個植株連同花盆一起浸泡在水中，將植株從花盆中小心取出，洗凈后，用WinRHIZO根系分析儀測定根表面積、根體積和根平均直徑；用Phillips and Hayamn [14]方法進行染色，統計菌根侵染率；將收獲的植株根系置于烘箱中，105 ℃烘干至恒重稱質量，計算生物量。

采用TTC法測定根系活力；采用NBT法測定SOD活性；采用愈創木酚法測定POD活性；采用紫外吸收法測定CAT活性；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量[15]。

1.4統計分析

所有試驗數據用SPSS 17.0進行平均值和標準誤差的計算，并進行方差分析和鄧肯多重比較。

2結果與分析

2.1接種AM真菌對高丹草根系菌根侵染率的影響

由圖1可知，4種基質上3種接種處理均獲得較高的菌根侵染率，且均存在顯著性差異，未接種處理菌根侵染率極低。在基質S1、S3和S4上接種G.m處理菌根侵染率均為最高（P<0.05），分別為65.41%、68.59%、58.00%，接種G.v處理菌根侵染率均較低，分別為35.36%、39.44%、42.39%；而在S2基質上接種G.mv處理菌根侵染率顯著高于其他2種接種處理，為67.14%，接種G.m和G.v處理間菌根侵染率差異不顯著。接種G.m處理基質S1和S3間菌根侵染率差異不顯著，基質S2和S4間無顯著差異。接種G.v和G.mv處理基質S2上菌根侵染率顯著高于其他基質，未接種處理4種基質間菌根侵染率無顯著差異。

[FK（W13][TPGYL1.tif]

2.2[JP3]接種AM真菌對高丹草根系形態、生物量和根系活力的影響

4種基質上接種AM真菌顯著增加了植物根系活力、根長、根表面積、根體積和根生物量，顯著降低根平均直徑（圖2，P<0.05）。在基質S1上，3種接種處理間根體積差異不顯著，接種G.v和G.mv處理間根長、根表面積、根生物量差異不顯著，顯著低于接種G.m處理。在基質S2上，接種G.v和G.mv處理間根長差異不顯著，接種G.v處理根表面積、根體積和根生物量顯著高于其他接種處理。在基質S3和S4上，接種G.m處理根長、根表面積、根體積和根生物量均顯著高于其他接種處理；基質S4上接種G.v和G.mv處理間根長和根體積差異不顯著。基質S1、S3和S4上接種G.v和G.mv處理間根平均直徑差異不顯著，但顯著高于接種G.m處理；基質S2上3種接種處理間根平均直徑無顯著差異。在基質S1和S4上，接種G.m處理根系活力顯著高于其他接種處理；在基質S2上，3種接種處理間根系活力差異不顯著；在基質S3上[CM（25]接種G.m和G.mv處理間根系活力差異不顯著，顯著高于[CM）]

[FK（W30][TPGYL2.tif]

接種G.v處理。基質S4根平均直徑顯著高于其他3種基質，3種礦區廢棄物基質中基質S3上高丹草其他各指標均高于基質S1和S2。

2.3接種AM真菌對高丹草根系抗氧化酶和MDA含量的影響

從圖3可以看出，與未接種處理相比，接種AM真菌顯著提高了SOD、POD、CAT活性，降低了MDA含量。基質S1、S2和S4上，接種G.v和G.mv處理間SOD、CAT活性差異不顯著；基質S1和S4上，兩者均顯著低于接種G.m處理；在基質S2上兩者均顯著高于接種G.m處理。基質S1和S3上接種G.m處理POD活性顯著高于其他接種處理，接種G.v處理顯著低于其他接種處理（P<0.05）；在基質S2和S4上，接種G.v 和G.mv處理間POD活性差異不顯著。基質S1上，接種G.m處理MDA含量顯著低于其他接種處理；在基質S2上，3種接種處理間MDA含量差異不顯著；在基質S3和S4上接種G.v和G.mv處理間MDA含量差異不顯著，顯著高于接種G.m 處理。3種礦區廢棄物基質上高丹草SOD、POD、CAT活性以及MDA含量顯著高于基質S4。基質S3上高丹草根系SOD、POD、CAT活性顯著高于其他2種煤礦廢棄物基質，MDA含量顯著低于其他2種煤礦廢棄物基質。

2.4高丹草根系抗氧化酶活性MDA含量與其他各指標相關性分析

由表2可知，菌根侵染率與根系活力、CAT活性呈極顯著正相關，與根平均直徑和MDA含量呈極顯著負相關，與根體積、根生物量呈顯著正相關，與根表面積、根長、SOD活性和POD活性呈正相關，但未達顯著水平；SOD活性和POD活性與根平均直徑均呈顯著負相關，與其他根系參數呈正相關，未達顯著水平；CAT活性與根系活力、根表面積和根體積呈顯著正相關，與根長和根生物量呈正相關，未達顯著水平；MDA含量與根平均直徑呈正相關，未達顯著水平，與其他各參數呈極顯著負相關。

3討論

本試驗中，4種基質上3種接種處理均具有較高的菌根侵染率，表明AM真菌與高丹草建立了良好的共生關系。4種基質不同，菌根侵染率以及菌種間的相互作用有差異，這種差異可能是因為4種基質的pH值、營養成分和有機質含量以及基質類型等理化性質存在顯著差異（表1），菌根侵染率及菌種間的相互作用受到基質類型、pH值、礦質營養和有機質含量等理化性質以及宿主植物等因素的綜合影響。菌根與基質以及宿主植物之間存在一定的選擇性，不同菌種對不同基[CM（25]質的適應和生存能力以及宿主植物的親和力不同，從而造在土壤逆境脅迫條件下，植物最先感受逆境脅迫的器官是根系。重金屬、鹽堿以及養分缺乏等脅迫條件均會抑制植物根系生長[17-19]。本試驗結果表明，煤礦廢棄物基質上高丹草根系生長受到抑制，接種AM真菌顯著增加了根長、根表面積、根體積，提高了根系活力，從而影響根系生物量，這與張中鋒等研究結果[18]以及相關性分析結果一致。表明在煤礦廢棄物復合逆境中AM真菌可能通過一定的途徑調整高丹草根系代謝途徑和方向，改變碳同化產物的分配比例和方向，進而改變根系形態和分布，增加了高丹草根系與土壤的接觸面積，促進了高丹草根系對水分和養分的吸收以及碳水化合物向根系的積累和分配，從而維持其功能行為，提高了高丹草對煤礦廢棄物復合逆境脅迫的抗性。此外，AMF可誘導高丹草根系產生更多生長素，且AMF孢子自身含有的微量生長素也可轉移到高丹草根系中，促進根系生長發育。在煤礦廢棄物復合逆境中接種AM真菌高丹草根平均直徑顯著降低，相關性分析表明菌根侵染率與根平均直徑呈極顯著負相關，說明AM真菌可能誘導高丹草根系更細小，使其易從煤礦廢棄物中吸收更多的水分和養分。一般認為，AM真菌對宿主植物侵染率越高，對促進植物生長的可能性也就越大[20]。本試驗中基質S1、S3和S4均符合這一規律，這與趙仁鑫等的研究結果[2，21]一致；然而在基質S2上，混合接種處理對高丹草的侵染率較其他接種處理高，但對高丹草根系生長的促進效果反而低于接種G.v處理，這與Bi等的研究結果[22]相似。這表明菌根對宿主植物的作用不完全由侵染率決定，可能與由于煤礦廢棄物基質類型、條件以及菌種的適應性不同，造成菌根共生關系中成本-收益不平衡有關。4種基質上高丹草根系生長表現為S4>S3>S2>S1，這與王輝等的研究結果[23]相似，說明與粉煤灰相比，高丹草更適合在煤矸石上生長，粉煤灰和煤矸石按一定比例混合可對粉煤灰和煤矸石的理化性質起到一定的改良作用。

研究表明，正常情況下，植物細胞內自由基的產生與清除處于動態平衡狀態，逆境脅迫下（如重金屬、鹽堿以及養分缺乏等）該平衡受到破壞，導致植物體內活性氧、自由基大量積累，引發膜脂過氧化作用，細胞膜系統受損，膜脂過氧化產物MDA積累，對植物造成嚴重傷害[19]。本試驗中，3種煤礦廢棄物基質上高丹草根系中MDA含量顯著高于正常基質，接種AM真菌顯著降低了根系中MDA含量，這與謝翔宇等的研究結果[19，24]一致。表明煤礦廢棄物復合逆境中高丹草根系活性氧含量增加，導致膜脂過氧化程度加劇，接種AMF可減緩該逆境下高丹草根系中膜脂過氧化程度，減輕細胞膜系統損傷。在逆境脅迫下，SOD、POD和CAT是植物的重要保護酶類。植物體內存在一個由SOD、POD和CAT等組成的活性氧自由基清除系統，正常環境下，SOD、POD、CAT及其他保護物質能夠維持植物體內ROS的產生和清除處于動態平衡狀態，從而降低ROS對植物細胞膜結構造成傷害的可能性[19]。本試驗發現，3種煤礦廢棄物基質上高丹草根系SOD、POD、CAT活性均高于正常基質，說明高丹草根系感受到煤礦廢棄物基質不利因子的脅迫信號時，由于自身的應激能力，可通過提高根系抗氧化酶活性來適應煤礦廢棄物的不良環境，郭紹霞等也發現了類似結果[25]。接種AM真菌顯著提高了煤礦廢棄物上高丹草根系中SOD、POD和CAT的活性，相關性分析結果證明了這一點。說明在煤礦廢棄物復合逆境中接種AMF可能促進了3種酶在mRNA水平上的表達[26]，增加了高丹草根系抗氧化酶活性，增強了根系中自由基的清除能力，降低了MDA含量，從而減輕了煤礦廢棄物不利因子對高丹草造成的膜傷害，增強其抗逆性。相關性分析顯示，高丹草根長、根表面積、根體積和根生物量與根系抗氧化酶活性呈正相關關系，與MDA含量呈負相關，表明AM真菌可通過改善高丹草根系酶促反應系統，提高根系抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化程度，來緩解煤礦廢棄物不利因子對高丹草根系的復合脅迫，影響其根系生長發育，提高其對該復合逆境的抗逆性。

4 結論

3種煤礦廢棄物基質上，高丹草根系生長受到抑制，根系形態指標和生物量顯著降低，MDA含量增加，由于高丹草自身對煤礦廢棄物基質不利因子的應激能力，根系抗氧化酶活性顯著增加。AM真菌很好地侵染了高丹草根系，接種AM真菌顯著提高了高丹草的根系活力，增加了根長、根表面積、根體積和根生物量，誘導高丹草根系保護酶（SOD、POD和CAT）活性提高，降低了膜脂過氧化產物MDA含量，從而緩解了煤礦廢棄物基質的不利因子對根系造成的損傷，維持高丹草的正常生長，提高其在煤礦廢棄物復合逆境中的抗逆性，并且接種G.m對粉煤灰以及粉煤灰和煤矸石混合基質上高丹草根系的促進作用最佳，而接種G.v更適于煤矸石基質上高丹草根系的生長。因此，在煤礦區廢棄地生態恢復中，為更好地發揮菌根的作用，應針對不同類型煤礦廢棄地接種不同的AM真菌，在一定程度上可解決礦區廢棄地植被生長受脅迫和易退化等問題，提高植被恢復效果。

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