硝酸還原酶介導的一氧化氮對植物鋁脅迫耐受性的增強作用

王華華++李焱++候俊杰

摘要：以擬南芥野生型、一氧化氮（NO）產生途徑相關突變體Atnoa1（NO合成酶缺失突變體）和nialnia2（硝酸還原酶缺失突變體）為材料，研究鋁毒害對擬南芥野生型、Atnoa1和nialnia2的影響。試驗結果顯示，不同濃度（0～200 μmol/L）AlCl3處理抑制了擬南芥中根的生長，野生型和Atnoa1突變體表現出一致的抑制趨勢，而nialnia2突變體中根生長的抑制程度更嚴重。進一步的結果顯示，AlCl3處理增加了擬南芥中丙二醛和活性氧（H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]）含量，野生型和Atnoa1突變體表現出一致的增加趨勢，而nialnia2突變體中丙二醛和活性氧含量增加幅度更大；此外，AlCl3處理顯著增加了擬南芥中還原型抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）的含量，野生型和Atnoa1突變體表現出一致的增加趨勢，而nialnia2突變體中AsA和GH含量增加幅度最小。這些結果表明，硝酸還原酶途徑介導的NO在增強植物抗鋁毒害過程中起著重要的作用。

關鍵詞：一氧化氮；鋁毒害；硝酸還原酶；一氧化氮突變體；耐受性

中圖分類號：Q945.78文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2016）12-0465-03

收稿日期：2016-02-11

基金項目：國家自然科學基金（編號：31301252）；河南師范大學優秀青年科學基金（編號：14YQ003）；河南師范大學博士啟動課題（編號：11129）；河南省高校科技創新團隊支持計劃（編號：15IRTSTHN020）。

作者簡介：王華華（1980—），男，湖北漢川人，博士，副教授，主要從事植物逆境生理研究。E-mail：hhwang04@163.com。

鋁毒害是酸性土壤中限制植物生長和作物產量的主要因子[1]。植物遭受鋁毒害最顯著的1個特征就是根生長受到抑制，根尖是鋁毒害的作用位點。當土壤pH值降低到5.5以下后，鋁以毒害的形式進入到土壤溶液中抑制根系生長，從而阻礙植物對水分和礦質營養的吸收，導致植物生長受抑制和作物產量下降[2]。因此，增強作物鋁耐受性是提高酸性土壤中作物產量的一個關鍵因素，有利于解決食物短缺和生物能源生產這一難題。

研究發現，鋁毒害會導致植物體內活性氧的過量產生，從而造成氧化脅迫傷害[3]。為了避免活性氧的過量積累，植物體內也形成了多種清除活性氧的機制，除了酶促抗氧化機制[如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等]外，還存在非酶促抗氧化機制[如還原型抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）等][4]。AsA、GSH是清除活性氧的2種重要抗氧化物質，二者含量的高低與植物的抗逆性密切相關[5]。有報道表明，維持轉基因植株中高水平的AsA和GSH含量可以增強植物對脅迫的耐受性[6]。但是對于鋁脅迫下抗氧化機制的信號調節仍有待進一步研究。

一氧化氮（NO）是一種重要的信號分子，參與植物生長發育和多種環境脅迫響應[7]。植物體內有2條重要的產生NO的潛在途徑：NO合成酶（NOS）和硝酸還原酶（NR）所介導的酶促途徑[8]。擬南芥NO的相關突變體Atnoa1（NOS缺失突變體）和nialnia2（NR缺失突變體）現已廣泛用來研究NO在植物中的生理功能，Atnoa1和nialnia2突變體表現為NO的積累減少。2種突變體均是由于NO產生途徑中關鍵酶的基因發生突變，使得2種突變體的NO產生量少于野生型，為從遺傳學的角度揭示NO在鋁毒害中的作用提供了良好的材料。前期研究結果表明，NO可增強植物對鋁毒害的耐受性[9]，但有關NO與植物抗鋁毒害的關系研究主要是通過運用外源NO供體、NO合成酶抑制劑、NO清除劑等獲得的藥理學證據，還未有更直接的遺傳學證據表明NO在鋁毒害中產生的作用以及鋁毒害下NO的產生來源。本研究以NO相關突變體Atnoa1和nialnia2為材料，從遺傳學角度進一步探討NO在鋁脅迫下植物耐受性的作用。

1材料與方法

1.1供試材料

擬南芥野生型（WT，Col-0型）、Atnoa1（NO合成酶缺失）和nialnia2（硝酸還原酶缺失）突變體植株。

1.2材料培養

首先將擬南芥種子用10%次氯酸鈉消毒15 min，然后用無菌水清洗3次，再將種子點播在含3%蔗糖、0.8%瓊脂的1/2 MS培養基（pH值=5.7）上。4 ℃春化3 d后，將培養皿轉至培養間垂直放置生長，培養條件：22 ℃、14 h光周期[光照度120 μmol/（m2·s）]、相對濕度為70%。

1.3材料處理

將生長10 d的擬南芥幼苗輕輕地從瓊脂板上移出避免傷害到根，然后轉移到含有不同濃度（0、25、50、100、200 μmol/L）AlCl3的1/2 MS培養基（pH值=4.5）瓊脂板上培養處理3 d。處理完畢后，將苗用蒸餾水洗凈后用于參數測定分析。

1.4測定方法

處理完成后收集擬南芥幼苗用于各項指標的測定。根相對伸長量的測定，用相機對處理后的擬南芥根部進行拍照，根長用ImageJ軟件進行分析，每個處理至少分析30條。丙二醛、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]含量測定參照Wang等的方法[9]；AsA和GSH的測定參照de Pinto等的方法[10]進行。當粗提液中不加入二硫蘇糖醇時，此時測得的數值為還原型AsA的含量。GSH的含量是總的谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的差值；所測指標測定時至少重復3次，取平均值。

2結果與分析

2.1不同AlCl3濃度處理對野生型、Atnoa1和nialnia2突變體根生長的影響

根生長抑制是植物遭受鋁毒害最為顯著的一個特征。為檢測擬南芥對鋁脅迫的敏感性，本研究檢測不同鋁濃度（0～200 μmol/L）[JP2]對根生長的影響。如圖1所示，在無鋁處理的培養基中，所有供試材料的根系生長均正常。鋁處理條件下，隨著鋁濃度增大，所有植株的根系伸長均呈現劑量效應關系抑制。野生型和Atnoa1突變體的根長變化趨勢相似，而nialnia2突變體的根系生長抑制程度更為明顯。例如，當用濃度為 100 μmol/L 的AlCl3處理后，野生型、Atnoa1突變體和nialnia2突變體根長抑制率分別達到41.7%、45.8%和 74.8%。這些結果說明nialnia2突變體比野生型表現出對鋁更敏感。

2.2鋁脅迫對野生型、Atnoa1和nialnia2突變體中MDA和活性氧含量的影響

MDA和活性氧含量是衡量氧化脅迫程度的2個重要指標。為了查明鋁毒害誘導的根生長抑制是否由于遭受氧化傷害所導致，本研究檢測了鋁脅迫對MDA和活性氧含量的影響。如圖2、圖3、圖4所示，在無鋁培養基中，所有供試材料中丙二醛（MDA）和活性氧（H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]）含量均無顯著差異。50 μmol/L的AlCl3處理下，擬南芥中MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量均顯著增加，野生型和Atnoa1突變體表現出一致的增加趨勢，而nialnia2突變體中MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]含量增加幅度更大。在野生型中，鋁脅迫下MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量比對照分別增加39.3%、48.8%和58.3%；在Atnoa1突變體，鋁脅迫下MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量比對照分別增加417%、48.4%和60.0%；在nialnia2突變體中，鋁脅迫下MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量比對照分別增加了 103.2%、1216%和113.7%。這些結果也說明nialnia2突變體比野生型受到了更為嚴重的氧化脅迫傷害。

2.3鋁脅迫對野生型、Atnoa1和nialnia2突變體中AsA和GSH含量的影響

還原型抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）是體內2種重要的小分子抗氧化劑，能夠清除體內過量活性氧，維持細胞內氧化還原平衡狀態，從而避免細胞遭受氧化傷害。為進一步查明鋁脅迫下nialnia2突變體比野生型對鋁更敏感以及遭受更嚴重的氧化傷害的原因，本研究檢測了鋁對AsA和GSH含量的影響。如圖5、圖6所示，在野生型和突變體對照植株中，AsA和GSH含量均無明顯差異。50 μmol/L AlCl3處理下，擬南芥中AsA和GSH的含量均顯著增加，野生型和Atnoa1突變體均表現出類似的增加趨勢，而nialnia2突變體中AsA和GSH含量增加幅度最小。鋁脅迫下，野生型、Atnoa1突變體和nialnia2突變體中AsA增加量分別達到72.5%、73.6%和22.6%，GSH增加量分別達到41.8%、45.1%和17.0%。這些結果說明鋁脅迫下nialnia2突變體中AsA和GSH含量增加幅度最小，其清除活性氧的能力也最弱。

3結論與討論

[JP2]鋁毒害會引起植物一系列生理生化進程的改變，從而導致植物根的生長及其功能受到抑制，最終造成作物減產。然而，所幸的是植物在遭受鋁毒害時，不同的植物體內可形成不同的耐受鋁毒害的機制[11]。有大量研究表明，NO作為信號分子參與了多種環境脅迫響應，如鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫、臭氧脅迫等[12]。因為植物細胞內存在一氧化氮合成酶（NOS）和硝酸還原酶（NR）2條NO產生的酶促途徑，所以用NO合成酶突變體Atnoa1、硝酸還原酶nialnia2突變體作為試驗材料，以研究分別阻斷這2種NO合成途徑后對擬南芥耐鋁能力的影響。先前的藥理學證據表明，NO參與了植物對鋁毒害的耐受性[9]，然而在遺傳學上的直接證據還未有報道。

植物根生長受到抑制是植物遭受鋁毒害時一個最顯著的特征。本研究結果顯示，鋁毒害明顯地抑制了擬南芥根的生長（圖1），表明擬南芥植株遭受到了鋁毒害；進一步的結果顯示，nialnia2突變體比野生型擬南芥和Atnoa1突變體對鋁毒害更敏感（圖1），表明硝酸還原酶途徑產生的NO可能參與了植物對鋁毒害的耐受性。

有報道表明，鋁毒害可對植物造成氧化脅迫，從而導致植物質膜脂質過氧化[13]。植物細胞中活性氧的過量累積是對植物遭受鋁毒害的一種反應[3]。為了進一步探討NO增強植物對鋁毒害耐受性的機制，本研究檢測了鋁毒害對野生型擬南芥和nialnia2、Atnoa1突變體中MDA和活性氧含量的影響。研究結果表明，鋁毒害明顯地增加了擬南芥植株中MDA和活性氧的含量，而且nialnia2突變體植株中增加的幅度最大（圖2、圖3、圖4），這些結果表明硝酸還原酶依賴的NO可能通過減輕植物遭受氧化脅迫程度從而增強植物對鋁毒害的耐受性。為了進一步查明NO緩解植物鋁誘導的氧化脅迫機制，本研究進一步檢測了鋁脅迫對野生型和突變體中AsA和GSH含量的影響。結果顯示，鋁增強了植株中AsA和GSH的含量，但是nialnia2突變體植株中增加的幅度最小（圖5、圖6）。這些結果表明，NO緩解鋁誘導的氧化傷害是通過調節AsA和GSH含量來清除過量活性氧而實現的。

綜上所述，本研究結果進一步證實NO參與了植物對鋁毒害的耐受性，而且硝酸還原酶途徑產生的NO參與了這一過程，NO通過調節AsA和GSH含量來清除過量活性氧，從而維持細胞內一個相對穩定的氧化還原平衡狀態，避免細胞遭受嚴重的氧化傷害，以此來適應鋁脅迫環境。然而，對于NO增強植物對鋁毒害耐受性的具體作用機制還有待進一步更深入地研究。

參考文獻：

[1]Kochian L V. Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1995，46：237-260.

[2]Ma J F. Plant root responses to three abundant soil minerals：silicon，aluminum and iron[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，2005，24（4）：267-281.

[3]Yamamoto Y，Kobayashi Y，Devi S R，et al. Aluminum toxicity is associated with mitochondrial dysfunction and the production of reactive oxygen species in plant cells[J]. Plant Physiology，2002，128（1）：63-72.

[4]Mittler R. Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance[J]. Trends in Plant Science，2002，7（9）：405-410.

[5]Farfan-Vignolo E R，Asard H. Effect of elevated CO2 and temperature on the oxidative stress response to drought in Lolium perenne L. and Medicago sativa L.[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2012，59：55-62.

[6]Eltayeb A E，Kawano N，Badawi G H，et al. Overexpression of monodehydroascorbate reductase in transgenic tobacco confers enhanced tolerance to ozone，salt and polyethylene glycol stresses[J]. Planta，2007，225（5）：1255-1264.

[7]Lamattina L，Garcia-Mata C，Graziano M，et al. Nitric oxide：the versatility of an extensive signal molecule[J]. Annual Review of Plant Biology，2003，54（4）：109-136.

[8]Neill S J，Desikan R，Hancock J T. Nitric oxide signaling in plants[J]. New Phytologist，2003，159（1）：11-35.

[9]Wang H H，Huang J J，Bi Y R. Nitrate reductase-dependent nitric oxide production is involved in aluminum tolerance in red kidney bean roots[J]. Plant Science，2010，179（3）：281-288.

[10]de Pinto M C，Francis D，de Gara L. The redox state of the ascorbate-dehydroascorbate pair as specific sensor of cell division [JP3]in tobacco TBY-2 cells[J]. Protoplasma，1999，209（1/2）：90-97.

[11]Zheng S J，Yang J L，He Y F，et al. Immobilization of aluminum with phosporus in roots is associated with high aluminum resistance in buckwheat[J]. Plant Physiology，2005，138（1）：297-303.

[12]Wang H H，Liang X L，Wan Q，et al. Ethylene and nitric oxide are involved in maintaining ion homeostasis in Arabidopsis callus under salt stress[J]. Planta，2009，230（2）：293-307.

[13]Wang Y S，Yang Z M. Nitric oxide reduces aluminum toxicity by preventing oxidative stress in the roots of Cassia tora L.[J]. Plant and Cell Physiology，2015，46（12）：1915-1923.