復合菌固體發酵降解木質素的條件優化

文婷 管維++周國英

摘要：以降解率和選擇系數為主要指標，采用單因素優化、均勻設計及正交設計試驗，對白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）固體發酵降解竹材木質素條件進行優化。結果表明，復合菌適宜的降解條件為酒石酸銨0.2 g/L、葡萄糖 14 g/L、Ca2+0.8 mmol/L、Mn2+0.6 mmol/L、接種量6%、含水量50%、溫度32 ℃、pH值5.0，固體發酵時間25 d時，竹材木質素降解率為60.29%，選擇系數為12.79。

關鍵詞：復合菌；固體發發酵；木質素；降解率；選擇系數

中圖分類號： S188+.4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0506-03

收稿日期：2015-10-28

基金項目：湖南省科技重大專項（編號：2011FJ1006）。

作者簡介：文婷（1985—），女，湖南衡陽人，碩士，主要從事微生物選育及發酵工程研究。E-mail：282637170@qq.com。

通信作者：周國英，博士，教授，博士生導師，主要從事林業微生物研究。E-mail：gyzhou2118@163.com。

我國竹質資源豐富，竹纖維具有綠色環保、吸濕透氣、天然抗菌和抗紫外線等特性，具有極大的市場潛力和附加值。竹纖維中的木質素嚴重影響了竹纖維產業化開發進程，而微生物降解木質素是解決這一問題的有效途徑之一。因此，本研究以木質素降解率和選擇系數為主要指標，采用單因素優化、均勻設計及正交試驗，對白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）固體發酵降解木質素條件進行優化，從而提高木質素的降解率和選擇專一性，為實現微生物固體發酵降解竹材木質素產業化打下基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源

白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）由中南林業科技大學微生物學實驗室分離、篩選并保藏。

1.1.2試劑與培養基

固體平板培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、pH值6、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、維生素B1 8 mg、蒸餾水1 L，于121 ℃，0.1 MPa濕熱滅菌 30 min。

液體發酵培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5g、維生素B1 8 mg、蒸餾水1 L，于121 ℃，01 MPa濕熱滅菌30 min。

固體發酵培養基：竹粉（40目）15.0 g、料液比1 g ∶[KG-*3]3 mL，合成培養液[1]，拌勻，于121 ℃，0.1 MPa濕熱滅菌30 min。

1.1.3儀器

HZQ-C型恒溫振蕩器、HPS-280型生化培養箱，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；AR2140型電子天平，奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；UV-1600紫外/可見分光光度計、北京瑞利分析儀器公司。

1.2方法

1.2.1制備種子液

用打孔器取直徑為8 mm的白腐菌菌落1塊于液體發酵培養基中，28 ℃、裝液量為400 mL/L、150 r/min 搖床培養3 d。

1.2.2固態發酵培養

將種子液按10%接種量（菌懸液濃度0.1億CFU/mL）接種至已滅菌的固體發酵培養基中，在溫度28 ℃、濕度80%的恒溫箱中靜置培養30 d。

1.2.3樣品木質素含量的測定采用Klason法[2-3]測定木質素含量。

1.2.4樣品纖維素含量的測定參考董榮瑩等的方法[4]測定纖維素含量。

1.2.5木質素降解選擇性系數木質素降解選擇性系數=木質素降解率/纖維素降解率。

1.2.6固體發酵降解木質素培養基組分的確定

保持固體培養基其他組分不變，依次改變培基的氮源、碳源和金屬離子種類，等量接種白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）菌懸液進行固體發酵。

確定最佳氮源、碳源和金屬離子后，利用DPS 9.50軟件進行均勻試驗設計[5]。根據預試驗結果及試驗可行性確定考察因素范圍，對篩選出的培養基組分進行優化，然后通過二次多項式逐步回歸分析試驗數據，建立回歸方程，通過指標最大預測值確定發酵培養基各組分的適合配比，并進行試驗驗證。

1.2.7確定固體發酵降解木質素的培養條件

采用優化后的固體培養基，以接種量、含水量、初始pH值、培養溫度、培養時間等因素為對象，通過正交試驗來確定最佳的固體發酵培養條件，如表1所示。

1.2.8最佳發酵條件的驗證

將白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）分別按照優化前后的降解條件進行固體發酵，分別測定竹材木質素的降解率及選擇系數。

2結果與分析

2.1固體發酵降解木質素的培養基

2.1.1碳源

分別在基礎培養基中添加濃度為1.0%的不同碳源，以葡萄糖為碳源時，白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）的降解能力明顯優于蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉，對木質素的降解率達到了40.21%，選擇性系數為5.26；以竹粉為碳源時，木質素降解率最低，為20.69%（表2），這可能是因為木質素本身并不能充當碳源[6]，自身的降解更依賴于培養基中新增加的底物碳源。因葡萄糖易于利用，既能提供菌株生長發育所需的碳源，又能提供促進菌株生長發育和降解竹材木質素所需的能量，因此選擇葡萄糖為碳源。

2.1.2氮源

分別在基礎培養基中添加濃度為0.5 g/L的不同氮源。由表3可見，以酒石酸銨為氮源時，發酵后木質素降解能力最高，降解率為41.91%，選擇系數為6.16。這說明添加酒石酸銨時，復合菌（HY-YY-ZYS）的降解能力優于添加其他幾種氮源。其中以酵母膏作氮源時，木質素降解率為3831%，略低于酒石酸銨，但明顯高于其他3種氮源，且選擇系數為4.36。由于酒石酸銨是木質素降解菌發酵工業中最常用的無機氮源，價格便宜，而且是合成木質素降解酶系中的重要氮源，能誘導該白腐菌種產木質素降解酶系，綜合考慮效果與原料成本，因此選擇酒石酸銨為氮源。

2.1.3金屬離子

分別在基礎培養基中添加濃度為 0.5 mmol/L 的金屬離子Fe3+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+。由表4可見，Mn2+和Ca2+有利于菌種生長，對產酶有一定的促進作用，木質素降解率分別為43.58%、42.19%，大于其他金屬離子，選擇系數分別為7.26、6.78，均高于其他金屬離子。可能由于金屬離子中Mn2+是酶的輔酶或激活劑[7-8]；Ca2+能影響細胞膜的通透性，既能促進菌體的基礎代謝，又能影響許多代謝產物的生物合成，因此選用Mn2+和Ca2+作為金屬離子組合，添加到培養基中進行下一步優化試驗。

2.1.4均勻設計法優化培養基

培養基中各組分之間有一定的內在聯系，在單因素試驗基礎上，考察培養基中碳源、氮源及金屬離子的含量對木質素降解率及選擇系數的影響，以尋求培養基中各組分的最佳配比。采用4因素15水平，對篩選出的碳源、氮源及金屬離子組分進行優化（表5）。

采用DPS 9.50軟件，對各因素水平對木質素降解率的影響結果，進行二次多項式逐步回歸分析，得到方程：y=1508-2.68x1+3.85x2+25.01x3+21.92x4+0.40x12-011x22-4.59x32-85.96x42。

相關系數r=0.928 9，F=4.861 3，P=0.035 1，剩余標準差s=2.096 2，調整后的相關系數為0.876 4，查表F0.05（4，10）=3.24，F>F0.05（4，10），回歸方程顯著。

根據回歸方程求ymax，當x1=0.2 g/L、x2=14 g/L、x3=08 mmol/L、x4=0.6 mmol/L時，ymax=46.18，預測區間為[43.50，51.68]。根據優化條件，進行3次固體發酵降解竹材木質素試驗驗證，最終平均結果為46.29，選擇系數為1072，試驗結果均在預測范圍內，且有明顯提高。

2.2固體發酵降解木質素的培養條件

根據表1設計正交表，考察5個因素4個水平，找出木質素最佳降解條件（表6）。按照優化后的培養條件，將白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）按正交表所列的試驗需要接種到竹材固體培養基上，然后測定木質素降解率（表7）。

由表7可見，因素C（溫度）有顯著性差異，5個因素對降解率的影響由大到小依次為C>D>B>E>A；由表6可見，因素C的關系為C3>C2>C1>C4，因此當溫度為32 ℃時，復合菌可以達到降解木質素的最適合狀態；因素D（pH值）的關系為D3>D2>D4>D1，當固體發酵初始pH值為5時，木質素降解的效果最適合；因素B（含水量）的關系為B3>B2>B4>B1，當含水量為50%時，復合菌可以達到降解木質素的最適合狀態；因素E（時間）的關系為E4>E3>E2>E1，當固體發酵時間在35 d時，木質素降解率最大，由于在固體發酵30 d之后木質素降解率變化不明顯，因此為了節約時間[CM（25]，選擇了E2，即當發酵25 d時，木質素降解率為最適合固[CM）]

體發酵時間；而因素A（接種量）的關系為A2>A3>A4>A1，即當接種量為6%時，木質素降解率最適合。

綜合分析，選擇的最優組合為A2B3C3D3E2，即當復合菌（HY-YY-ZYS）在固體發酵條件為接種量6%、含水量50%、溫度32 ℃、pH值5、固體發酵時間25 d時，木質素降解效率最好。

2.3最佳降解條件的驗證

將復合菌（HY-YY-ZYS）按照優化前后的降解條件固體發酵，分別測定竹材木質素降解率及選擇系數。結果表明，在原始條件下，白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）竹材木質素降解率為38.54%，選擇系數為3.64；經過降解條件優化后，白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）竹材木質素降解率為6029%，選擇系數為12.79，降解率增加了21.75百分點，選擇系數增加了9.15，降解時間縮短5 d，竹材木質素降解率、選擇系數，生產效率明顯提高，且降低了生產成本。

3結論與討論

白腐菌降解木質素主要是在次生代謝期間產木質素降解酶，從而達到降解木質素的作用。影響木質素降解酶生物合成的培養基成分主要因素有碳源、氮源、金屬離子、初始pH值、誘導劑和表面活性劑等，為菌株營造一個有利于木質素降解酶系形成和運行的發酵環境，是生物降解木質素研究的重要內容[9-12]。本研究以降解率和選擇系數為主要指標，采用單因素優化方法結合均勻設計試驗，對白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）固體發酵降解竹材木質素培養基條件進行了優化：酒石酸銨0.2 g/L、葡萄糖14 g/L、Ca2+ 0.8 mmol/L、Mn2+ 0.6 mmol/L 時，降解率為46.29%，選擇系數為10.72。

白腐菌固體發酵降解木質素培養條件主要因素有接種量、氧氣濃度、溫度、含水量等[13]。本研究以降解率和選擇系數為主要指標，采用正交設計試驗，對白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）固體發酵降解竹材木質素培養條件進行優化，得到最優組合為A2B3C3D3E2，即當復合菌（HY-YY-ZYS）的固體發酵條件為接種量6%、含水量50%、溫度32 ℃、pH值=5，固體發酵時間25 d時，木質素降解率最高。將復合菌（HY-YY-ZYS ）分別按照優化前后的降解條件固體發酵，分別測定竹材木質素降解率及選擇系數，進行最佳降解條件的驗證。結果表明，在原始條件下，白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）竹材木質素降解率為38.54%，選擇系數為3.64；經過降解條件優化后，白腐真菌組合（HY-YY-ZYS）竹材木質素降解率為60.29%，選擇系數為12.79，降解率增加了21.75百分點，選擇系數增加了9.15，降解時間縮短5 d，竹材木質素降解率、選擇系數、生產效率均得到了明顯提高，且降低了生產成本。

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