高產磷脂酶D菌株的篩選、鑒定及發酵條件優化

楊學利++張璐++王一丁

摘要：利用平板篩選法、薄層色譜（thin layer chromatogrophy，簡稱TLC）層析及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）定量分析，從土壤中分離得到1株具有較高磷酰基轉移活性的菌株。對該菌株進行形態學觀察、生理生化鑒定及16S rRNA序列分析，鑒定其為鏈霉菌屬（Streptomyces），與李色鏈霉菌（Streptomyces prunicolor）同源性最高。針對該菌株的發酵培養條件進行單因素試驗、Plackett-Burman試驗、響應面法（response surface methodology，簡稱RSM）分析，最終確定菌株最佳產酶條件為可溶性淀粉15.0 g/L、牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）15.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、初始pH值7.3、發酵溫度30.5 ℃、發酵周期99 h；在該條件下菌株的酶活達到36.06 U/L，比原始發酵培養基提高了65.3%。

關鍵詞：磷脂酶D；篩選；鑒定；薄層色譜法；響應面法分析；酶活性；李色鏈霉菌

中圖分類號： TQ920.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0521-05

收稿日期：2015-10-28

作者簡介：楊學利（1985—），女，山東省聊城人，碩士，研究方向為應用微生物學。E-mail：yangxueli2007@126.com。

通信作者：王一丁，博士，教授，碩士生導師，研究方向為應用與環境微生物學。E-mail：wangyiding@sicnu.edu.cn。

磷脂酶D（phospholipase D，簡稱PLD）催化磷脂質的磷酸二酯鍵水解生成磷脂酸和羥基化合物，此外PLD還通過磷酰基轉移作用催化磷脂質的極性頭部基團轉移。其中尤為重要的是PLD的磷酰基轉移作用，它可以將自然界大量存在的磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，簡稱PC）催化合成為其他的稀有磷脂，如磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，簡稱PG）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，簡稱PS）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，簡稱PE）等[1]。PS因獨特的理化性質和營養價值在食品、化妝品、藥品中有重要作用，并受到了國際社會的認可。2015年4月，石家莊君樂寶乳業有限公司率先推出國內首款添加磷脂酰絲氨酸的兒童奶粉，開創了國內高端兒童奶粉的先河。

來源于微生物的PLD具有較強的轉磷脂能力和較廣泛的底物專一性，近年來國內外學者報道的微生物種類主要集中于芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌、大腸桿菌[2-5]，其中又以來源于鏈霉菌屬的PLD的轉磷脂活性最高。

本研究從菜籽油廠土樣中篩選高產PLD菌株，并從形態學、生理生化及16S rRNA序列分析對菌株進行鑒定；對該菌株發酵條件進行優化，通過響應面法[6]分析影響發酵因素的交互作用，尋找最優的發酵條件。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品

土壤采自四川省眉山市彭山區某菜籽油廠廠區。

1.1.2試劑

磷脂酰膽堿標品、磷脂酰絲氨酸標品均購自美國Sigma公司；色譜純乙腈、色譜純甲醇、色譜純磷酸均購自國藥集團化學試劑有限公司；DNA提取試劑盒、PCR試劑均購自北京天根生化科技有限公司；PCR測序引物由上海生工生物工程有限公司合成；其他試劑均為分析純。

1.1.3培養基

富集培養基：磷脂酰膽堿（PC）5.0 g/L，NaCl 0.25 g/L，pH值自然，121 ℃滅菌15 min。

分離培養基：磷脂酰膽堿（PC）5.0 g/L，KNO3 5.0 g/L，K2HPO4 0.25 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L，NaCl 0.25 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.0～7.4，121 ℃滅菌15 min。

種子培養基：葡萄糖10.0 g/L，酵母膏20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

基礎發酵培養基：葡萄糖10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；基礎固體培養基在基礎發酵培養基的基礎上添加2%瓊脂。

1.2試驗方法

1.2.1菌株富集與分離

采用四分法取土樣1 g，接入 50 mL 的富集培養基中，30 ℃、200 r/min條件下活化培養 5 d。富集培養液經103～107倍梯度稀釋后，吸取2 mL均勻涂布于分離平板上。挑取長勢良好的菌落分離、純化，直至得到單一菌株的純培養物。

1.2.2粗酶液的制備

將分離得到的單菌落分別在基礎發酵培養基進行發酵培養，發酵條件為30 ℃、200 r/min培養 3 d。培養后的發酵液在8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液即為粗酶液。

1.2.3磷脂酶D活力的測定

用發酵提取的粗酶液催化PC與絲氨酸生成PS來測定PLD的活力。反應體系：有機相為溶解4 mg/mL PC的乙醚溶液，水相為溶解0.2 g/mL絲氨酸的pH值5.5、0.02 mol/L醋酸緩沖溶液，兩相混合后于 30 ℃、200 r/min下反應4 h。待反應完畢后將溶液靜置，取有機層進行蒸發，再將蒸發后的產物按V三氯甲烷 ∶[KG-*3]V甲醇=2 ∶[KG-*3]1溶解。酶活力單位定義為30 ℃條件下，1 min之內由PC轉化成 1 μmol PS所需要消耗的酶量。

1.2.3.1TLC定性分析

將V三氯甲烷 ∶[KG-*3]V甲醇 ∶[KG-*3]V水按65 ∶[KG-*3]25 ∶[KG-*3]4的比例配制搖勻，將展開劑在層析缸中預飽和20 min。將硅膠GF254板在105 ℃下活化30 min后取出，放入干燥器中冷卻待用。用點樣毛細管在距離底端約1 cm的同一水平上依次點磷脂酰膽堿標品、磷脂酰絲氨酸標品、待測樣品溶液，放入展開缸中展開45 min后將層析板取出，自然晾干后在 254 nm 下進行熒光觀察。

1.2.3.2HPLC定量分析

按V流動相乙腈 ∶[KG-*3]V甲醇 ∶[KG-*3]V磷酸=85 ∶[KG-*3]15 ∶[KG-*3]1.5 配制搖勻；流速為1.0 mL/min，在205 nm下進行檢測。利用外標法，以PS標品為標準，定量分析檢測結果。

1.2.4菌體濃度測定

取一定體積的發酵液在10 000 r/min條件下離心10 min，再用dd H2O沖洗，離心2次后得到菌體。離心管在裝發酵液前置于105 ℃烘箱烘至恒質量（m0），離心后再將離心管置于同樣條件下烘至恒質量（m1），菌體濃度計算公式：菌體濃度=（m1-m0）/V。

1.2.5菌株培養特征及生理生化鑒定

菌落培養特征和生理生化特征參照文獻[7]進行。

1.2.616S rRNA鑒定及系統發育樹構建

按照試劑盒的操作步驟提取菌株DNA，然后進行16S rRNA PCR擴增，將PCR產物送往華大基因檢測有限公司測序，測序結果在NCBI上Blast序列分析及EzTaxon（http：//www.ezbiocloud.net/）比對。根據序列分析及比對結果構建篩選菌株的系統發育樹。

1.2.7菌株的發酵條件優化

分別選取碳源、氮源、接種量、初始pH值、發酵溫度、發酵時間6個方面進行菌株發酵條件優化單因素試驗。對優化后的發酵條件再進行Plackett-Burman（PB）試驗，選取3個對發酵條件影響最顯著的因素，進行響應面法分析，從而得到最佳的發酵條件。

2結果與分析

2.1菌株初篩結果

以磷脂酰膽堿為唯一碳源進行產磷脂酶D菌株的篩選，篩選得到平板上3株長勢良好的菌株，分別為ML-Y002、ML-Y005、ML-Y006；再將這3株菌株進一步采用搖瓶發酵復篩，比較各菌株的產酶能力。

2.2菌株復篩結果

2.2.1TLC檢測

將初篩到的3株菌株進行搖瓶發酵，檢測是否具有磷酰基轉移活性，即是否能催化PC和絲氨酸生成PS。由圖1可以看出，篩選出的3株菌株均有磷酰基轉移能力，進一步通過HPLC測定其磷酰基的轉移能力。

[TPYXL1.tif]

2.2.2HPLC活性檢測

用基礎發酵培養基對ML-Y002、ML-Y005、ML-Y006等3株菌株進行發酵，取上清液檢測PLD活性，活性分別為（18.66±0.21）、（12.23±0.49）、（2181±0.34）U/L。選取活性最高的ML-Y006做進一步研究。

2.3電鏡鑒定

菌株ML-Y006在燕麥粉瓊脂（ISP-3）培養基上長勢良好，形成具有高度分化的氣生菌絲和基內菌絲，菌絲有橫隔、不斷裂。菌落表面呈皺褶狀，顏色呈灰白色；基內菌絲呈紫褐色，產生淺褐色可溶性色素。在掃描電鏡下發現，孢子絲長，呈直或略柔曲；孢子橢圓形、長圓形，表面光滑（圖2）。

[TPYXL2.tif]

2.4菌落培養特征及生理生化檢測

培養特征：菌株ML-Y006在ISP-3培養基、無機鹽-淀粉瓊脂培養基、酵母膏-麥芽汁瓊脂培養基上長勢良好，氣生菌絲均為灰白色，基內菌絲淺黃色或灰白色，無可溶性色素。生理生化特征：經試驗，菌株ML-Y006能使酯酶、淀粉水解；不產生H2S；牛奶胨化；硝酸鹽不還原，不能分解色氨酸，甲基紅（M-R）試驗陰性。生長溫度為9～40 ℃，最適溫度為30 ℃。

2.5系統發育樹構建及菌株鑒定結果

對菌株ML-Y006進行16S rRNA分子鑒定，采用通用引物進行PCR擴增后，獲得約1 500 bp的片斷，將測序得到的序列通過Blast與NCBI GenBank數據庫中已報道序列進行同源性對比，構建系統發育樹。由圖3可以看出，ML-Y006菌株經鑒定屬于鏈霉菌屬，與李色鏈霉菌（Streptomyces prunicolor）相似度為100%且在同一分支。根據生理生化及16S rRNA綜合分析鑒定該菌株為李色鏈霉菌（Streptomyces prunicolor）。

2.6發酵條件優化

2.6.1碳源對菌體發酵產酶的影響

以基礎發酵培養基為基礎，30 ℃、初始pH值6.0、200 r/min搖瓶培養72 h后測菌株酶活和菌體濃度。分別添加質量濃度均為10.0 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油作為唯一碳源，并以不加碳源作為空白對照。由圖4可以看出，當碳源為可溶性淀粉時，ML-Y006菌株酶活最高；葡萄糖為碳源時，酶活次之，其他3種碳源對酶活提高較少。還可以看出，酶活的高低和菌體濃度的大小基本成正比關系，故選用可溶性淀粉為最佳碳源。

其他培養基成分不變，分別加入不同質量濃度的可溶性淀粉作為碳源來做單因素試驗，并設置空白對照，考察其對酶活及菌體生長的影響。由圖5可以看出，隨著可溶性淀粉質量濃度的增加，酶活快速增加，當可溶性淀粉質量濃度為 15 g/L 時，酶活最高；當質量濃度再增加到20 g/L后，菌體濃度和酶活逐漸降低。因此選取15 g /L作為可溶性淀粉的最佳添加量。

2.6.2氮源對菌體發酵產酶的影響

以基礎發酵培養基為基礎，30 ℃、初始pH值6.0、200 r/min條件下搖瓶發酵培養72 h，測菌株酶活和菌體濃度，分別添加質量濃度為10 g/L的牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏+蛋白胨（質量比為1 ∶[KG-*3]1）、酵母浸粉、NaNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4作為唯一氮源，并以不添加氮源作為空白對照。由圖6可以看出，有機氮有利于菌體生長及酶活提高，而無機氮不利于酶活的提高或提高較少，且不利于菌體生長。對酶活提高最多的為牛肉膏+蛋白胨，其次為蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉。由圖6還可以看出，酶活的高低和菌體濃度的大小基本成正比關系。因此，選用牛肉膏+蛋白胨為最佳氮源。

其他培養基成分不變，分別加入不同質量濃度的牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）作為氮源做單因素試驗，并設置空白對照，考察其對酶活及菌體生長的影響。由圖7可以看出，氮源濃度對酶活和菌體生長影響較大，濃度小于15 g/L時，隨濃度提高酶活和菌體濃度均為上升趨勢，大于15 g/L時，酶活開始下降，菌體濃度變化較小，故選擇牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）濃度為 15 g/L 作為最佳氮源。

2.6.3接種量對菌體發酵產酶的影響

以基礎發酵培養基進行培養，其他條件不變對接種量進行優化，由圖8可以看出，接種量對酶活影響不明顯，接種量在1%～2%時，酶活提升較快；當接種量大于2%時，酶活和菌體溶度逐漸降低。依照酶活大小，確定2%為最適接種量。同樣可以看出，酶活的高低與菌體濃度的大小基本成正比關系。

2.6.4培養基初始pH值對菌體發酵產酶的影響

以基礎發酵培養基進行培養，其他條件不變對發酵培養基初始pH值進行優化。由圖9可以看出，發酵培養基初始pH值對酶活影響較為顯著，當pH值在4～7時，酶活有大幅度提高，pH值在8～11時，酶活大幅下降。依照酶活的大小，確定pH值7為最適發酵培養基的初始pH值。

2.6.5發酵溫度對菌體發酵產酶的影響

以基礎發酵培養基進行培養，其他條件不變，對發酵溫度進行優化。由圖10可以看出，發酵溫度在18～30 ℃時，酶活緩慢增加，并達到最大值，發酵溫度大于30 ℃時，酶活開始下降。還可以看出，酶活與菌體濃度之間仍呈正相關性。依照酶活的大小，確定 30 ℃ 為最適發酵溫度。

2.6.6培養時間對菌體發酵產酶的影響

以基礎發酵培養基進行培養，其他條件不變，對發酵周期進行優化。由圖11可以看出，發酵24～96 h時，酶活一直處于增加狀態，并在 96 h 時達到最大值；當發酵超過96 h時，酶活快速下降而菌體濃度變化較弱。依照酶活的大小，確定96 h為最適發酵周期。

2.6.7菌株發酵條件的響應面分析

經Design Expert 8.0中Plackett-Burman分析，篩選對酶活影響顯著的發酵條件。如果P<0.05，說明該因素在模型中具有顯著性影響。由表1可以看出，影響最為顯著的3個因素由大到小分別為初始pH值>發酵溫度>發酵時間。

將影響最為顯著的3個因素，以單因素試驗最優條件為中心點，進行3水平試驗，再進行響應面Box-Behnken分析。分析結果如表2、圖12，根據分析顯示R2=0.919 4，回歸系數較[CM（25]好，結果可信；P值為0.004 4，模型顯著。運用該模型求得[CM）]

各因素最佳取值：初始pH值為7.29、發酵溫度為30.52 ℃、發酵周期為99.37 h，預測酶活為35.476 2 U/L。應用該發酵條件：可溶性淀粉15.0 g/L、牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）15.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、初始pH值 7.3、發酵溫度30.5 ℃、發酵周期99 h，進行3個批次試驗，試驗結果平均為（3606±0.61）U/L，預測結果與試驗結果非常接近。

3結論與討論

本研究經過大量試驗分析篩選得到1株磷酰基轉移能力較強的菌株ML-Y006，經形態學觀察、生理生化試驗和16S rRNA分析鑒定，確定該菌株為李色鏈霉菌。通過單因素試驗、PB試驗及響應面分析，確定了該菌株的最佳產酶條件為可溶性淀粉15.0 g/L、牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）15.0 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、初始pH值7.3、 發酵溫度30.5 ℃、發酵周期99 h，在該條件下菌株酶活達到3606 U/L，較優化前酶活提高了65.34%，效果較為顯著，為后續擴大應用奠定了良好基礎。

PLD菌株多從富含有卵磷脂的環境中篩選，如大豆油土樣、香油土樣以及豆瓣中[2，8-9]，本研究首次從菜籽油土樣中進行PLD菌株的篩選。據報道，高產的PLD菌株多為放線菌，尤其是產酶較豐富的鏈霉菌屬，與本研究篩選結果一致。大部分文獻報道的產PLD菌株的活性測定多以PLD水解活性為測定指標，如董丹等測定PLD產生的游離脂肪酸[9]，梁麗敏等測定PLD產生的膽堿[10]，但PLD水解活性高的菌株或酶不一定具有同樣高的轉酯酶活性。本研究直接以PC與絲氨酸合成PS的轉酯酶活性為檢測指標來篩選菌株及優化培養基，為進一步研究酶法轉化PS的擴大生產奠定了基礎。

常規優化發酵培養條件多采用將其他因素固定的單一因素試驗，容易忽略因素間的交互作用而得出錯誤的結論，不能實現真正的最優化。響應面法是多變量系統尋優的試驗策略：首先確定對發酵最可能具有影響的營養和培養條件，然后用Plackett-Burman試驗進行影響因素篩選，尋找到對發酵影響顯著的因素，對影響顯著因素用響應面法進行優化，建立的模型用于預測獲得最大期望響應的水平[11]。本研究對篩選菌株發酵條件的優化，在單因素試驗的基礎上，利用Plackett-Burman試驗找到影響顯著的因素，進而進行響應面法分析，預測的最優發酵條件與實際接近，發酵酶活提升較大。

在發酵培養基的研究中，當可溶性淀粉濃度大于15 g/L或牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）濃度大于15 g/L時，酶活逐漸下降，可能的原因是可溶性淀粉或牛肉膏+蛋白胨的增多會增加培養基的黏度和滲透壓，黏度會影響發酵液中溶解氧的濃度，高的滲透壓可能導致細胞脫水死亡，從而影響菌體生長和酶活產物的合成[12]。氮源的優化中，有機氮測定的酶活遠遠高于無機氮，可能有機氮在提供氮源的同時，還可以提供一些微生物生長的營養物質，如蛋白質、氨基酸、肽類、維生素、微量元素等[13]。

本研究所用的粗酶液即為發酵上清液，酶含量較低，且含有培養基等成分，可能對酶活反應有一定影響。在接下來的研究中，首先將發酵產生的PLD進行純化，用提純的酶研究合成PS反應條件，找到最優的PS合成工藝，為擴大生產奠定基礎；再者擴大反應底物，來合成價值較高的磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）等反應產物，擴大PLD的使用范圍。

參考文獻：[HJ1.75mm]

[1]Damnjanovi[KG-*5]c[DD（-1*2/3][HT6]'[DD）] J，Iwasaki Y. Phospholipase D as a catalyst：application in phospholipid synthesis，molecular structure and protein engineering[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2013，116（3）：271-280.

[2]代書玲，張江，商軍. 磷脂酶D高效產生菌的篩選及鑒定[J]. 江蘇農業科學，2013，41（3）：309-311.

[3]王興國，裘愛泳，陶文沂，等. 高堿基轉移活性磷脂酶D生產菌種的篩選及酶性質研究[J]. 無錫輕工大學學報，1996，15（3）：209-213.

[4]Liu Y，Zhang T，Qiao J，et al. High-yield phosphatidylserine production via yeast surface display of phospholipase D from Streptomyces chromofuscus on Pichia pastoris[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（23）：5354-5360.

[5]Zhang Y N，Lu F P，Chen G Q，et al. Expression，purification and characterization of phosphatidylserine synthase from Escherichia coli K12 in Bacillus subtilis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（1）：122-126.

[6]華承偉，于江傲，謝鳳珍. 紅色鏈霉菌發酵產紅霉素培養基的響應面優化[J]. 中國生物制品學雜志，2011，24（6）：728-731.

[7]徐麗華，李文均，劉志恒，等. 放線菌系統學：原理、方法及實踐[M]. 北京：科學出版社，2007.

[8]Simkhada J R，Cho S S，Lee H J，et al. Purification and biochemical properties of phospholipase D （PLD57） produced by Streptomyces sp. CS-57[J]. Archives of Pharmacal Research，2007，30（10）：1302-1308.

[9]董丹，蔣麗，關統偉，等. 豆瓣中產磷脂酶菌株的篩選及系統發育分析[J]. 中國釀造，2015，34（3）：44-47.

[10]梁麗敏，劉春鳳，杜陽吉. 鏈霉菌產磷脂酶D發酵培養基的優化[J]. 中國食品添加劑，2014（9）：114-120.

[11]江元翔，高淑紅，陳長華. 響應面設計法優化腺苷發酵培養基[J]. 華東理工大學學報：自然科學版，2005，31（3）：309-313.

[12]韓海霞，曹棟，史蘇佳，等. 鏈霉菌CA-1產磷脂酶D發酵條件的優化[J]. 食品工業科技，2014，35（13）：176-180.

[13]趙紫薇，楊天奎，牟英. 色褐鏈霉菌產磷脂酶D的發酵條件研究[J]. 中國油脂，2010，36（11）：52-57.