厭氧產乙酸菌株ZY—3的篩選、鑒定及產酸條件

習彥花 張麗萍++崔冠慧++王慧++邢清朝 王雅娜

摘要：為篩選高效厭氧水解產乙酸菌，將其應用于高濃度有機廢水的厭氧生物處理，強化產乙酸菌群的產乙酸作用，提高消化效率。采用Hungate厭氧操作技術以及選擇性培養基分離篩選高效產乙酸菌，經生態學、生理生化、16S rDNA序列同源性分析對菌株的發酵產酸特性進行分析鑒定。結果表明，從污水處理廠活性污泥中分離出1株厭氧水解產乙酸菌 ZY-3，經鑒定為雙酶梭狀芽孢桿菌（Clostridium bifermentans）。該菌株在以麥芽糖為碳源、初始pH值為7.5、30 ℃溫度下培養12 h，乙酸產量最高達1 346.7 mg/L；在添加0.4 mol/L NaCl的發酵培養基中可正常生長且產酸量較0、0.2 mol/L NaCl處理增加，高達1 588.7 mg/L。菌株ZY-3產酸能力強，發酵性能穩定，還能利用丙酸鹽發酵產乙酸，對加速乙酸轉化、防止丙酸積累、提高厭氧消化效率具有重要意義。

關鍵詞：活性污泥；雙酶梭狀芽孢桿菌（Clostridium bifermentans）；分離鑒定；產酸條件

中圖分類號： Q939.9；X703文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0526-03

收稿日期：2015-10-28

[JP2]基金項目：河北省科技支撐計劃（編號：14222901D、14273801D）；河北省財政預算（編號：15302）；河北省青年基金（編號：C2015302018）。

作者簡介：習彥花（1986—），女，河北石家莊人，碩士，助理研究員，主要從事能源微生物及生物質資源綜合利用技術研究。Tel：（0311）83014879；E-mail：xiyanhua86@163.com。

通信作者：程輝彩，博士，副研究員，主要從事生物質能源方面的研究。E-mail：huicaicheng@163.com。

高濃度有機廢水的厭氧生物處理技術因具有有效、簡單、費用低廉等特點而被全世界廣泛應用[1]。然而在厭氧工藝中仍有諸多不足之處，例如由于厭氧細菌增殖較慢而導致的厭氧反應器初次啟動過程緩慢、出水揮發性脂肪酸（volatile fatty acid，簡稱VFA）含量較高、大量丙酸積累導致系統發生酸化等[2-5]。馬超等認為，產氫產乙酸菌群的產乙酸作用是厭氧消化過程的第一限速步驟，乙酸途徑生成的甲烷約占甲烷生成總量的2/3[6-8]，因此篩選能利用丙酸鹽發酵產乙酸的高效菌株，強化產乙酸菌群的產乙酸作用，是防止丙酸積累、提高厭氧消化系統負荷率、提高處理效率和運行穩定性的關鍵。近年來，國內外學者對各類發酵產酸菌群的生理生態學研究，尤其對作為第一限速步驟的產乙酸菌的研究越來越多[9-10]。

本研究通過選擇性培養基從污水處理污泥中分離篩選到1株高效厭氧產乙酸菌，對它進行菌種鑒定以及發酵產酸特性研究，旨在為廢水厭氧處理的生物強化作用提供菌種資源。通過將其人工接種到厭氧生物處理系統中，以提高厭氧反應器中生物持有量，加快產酸發酵菌群的產物——VFAs和乙醇等轉化為乙酸的速率，解除大量因丙酸積累造成系統酸化問題，并為產甲烷菌群提供更加豐富的底物——乙酸，增強代謝活性，提高厭氧生物處理效能。

1材料與方法

1.1樣品

從石家莊橋東污水處理廠采集3份活性污泥樣品、5份水樣。

1.2培養基

選擇性培養基：胰蛋白胨0.25 g/L，酵母提取物 0.5 g/L，蛋白胨0.25 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，NaCl 1.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4 0.5 g/L，0.1%刃天青指示劑2滴，pH值7.0～7.2。

無機鹽培養基：L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，NaCl 15 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4 0.5 g/L，0.1%刃天青指示劑2滴，pH值7.0～7.2。

1.3菌株篩選方法

取1 g泥樣（或1 mL水樣）加入10 mL無氧滅菌的培養基中富集培養，傳代穩定后采用改良Hungate滾管技術進行純菌滾管分離。

1.4菌種鑒定

通過形態學觀察、生理生化試驗[11-12]和16S rDNA序列比對進行菌種鑒定。

1.5產酸特性

1.5.1培養溫度對菌株產酸的影響

分別測定在4、16、25、30、37、45 ℃條件下，培養12 h菌株的生長狀況及產酸情況。

1.5.2初始pH值對菌株ZY-3產酸的影響

在最適生長溫度條件下，分別測定菌株在初始pH值為5.5、6.0、6.5、70、7.5、8.0、8.5、9.0培養條件下的生長及產酸情況。

1.5.3不同碳源對菌株產酸的影響

在最適生長溫度及初始pH值條件下，分別測定菌株在以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、檸檬酸、甘露醇、甘油、丙酸鈉、丁酸鈉為碳源的培養條件下的生長及產酸情況。

1.5.4耐鹽性研究

在培養基中分別添加0（CK）、0.2、04、0.8、1.2 mol/L的NaCl，測定菌株的生長狀況及產酸情況，并分析菌株的耐鹽程度。以上試驗均重復3次，取平均值。

1.6分析方法

1.6.1菌體濃度測定

用751紫外分光光度計，在510 nm處測定供試樣品的吸光度，作為菌體濃度。

1.6.2液相末端產物分析

乙酸含量的測定方法參考文獻[13]。

2結果與分析

2.1菌株的分離鑒定

2.1.1菌株的篩選

從污水處理廠活性污泥及水樣中分離得到乙酸產量較高的14株菌株。經厭氧發酵復篩，獲得1株高效厭氧水解產乙酸菌株ZY-3，乙酸平均產量為 1 110.6 mg/L。

2.1.2菌株的形態特征

菌株ZY-3在選擇性培養基上的菌落呈現白色或乳白色，不規則圓形，不透明。經光學顯微鏡觀察，菌體呈桿狀[（0.5～0.6） μm×（1.0～3.0） μm]，單個或短鏈，偶見長鏈；孢子卵圓形，中到次端生（圖1）。該菌株在液體培養基中培養形成黏的沉淀。

[FK（W20][TPXYH1.tif；S+3mm]

2.2菌株ZY-3生理生化特征

由表1可見，菌株ZY-3為嚴格厭氧菌，革蘭氏染色、明膠液化、甲基紅試驗、吲哚試驗、葡萄糖發酵產H2試驗均為陽性；淀粉水解、硝酸鹽還原試驗為陰性；可利用多種糖如纖維二糖、D-葡萄糖、果糖、麥芽糖等產酸，以丙酸鹽、丁酸鹽等為發酵底物。

2.3菌株ZY-3的16S rDNA序列測定與分析

菌株ZY-3經PCR擴增、16S rDNA序列分析表明，其16S rDNA長度為1 376 bp。將序列輸入GenBank，以16S rDNA同源性為基礎所構建的包括親緣關系最近的菌株比對分析表明，菌株ZY-3屬于梭狀芽孢桿菌屬的雙酶梭狀芽孢桿菌（Clostridium bifermentans）（圖2）。

2.4菌株ZY-3的生長狀況及產酸特性

2.4.1培養溫度對菌株ZY-3生長與產乙酸的影響

由圖3可見，菌株ZY-3最適培養溫度為30～37 ℃。隨著溫度升高，菌體濃度也相應增加，37 ℃時，菌體濃度達到最大值；30 ℃ 培養溫度下，乙酸產量最大，為1 364.3 mg/L；溫度高于 37 ℃ 后菌體濃度及乙酸產量快速下降，45 ℃時基本無生長。在12 h培養過程中，乙酸產量同菌體濃度變化趨勢基本一致。

2.4.2不同初始pH值對菌株ZY-3生長和產酸的影響

pH值對微生物的生理代謝影響很大。由圖4可見，當pH值為7.5時，菌株ZY-3的菌體濃度最大，與pH值為7.0時無明顯差異；菌株ZY-3在pH值7.5時有最大乙酸產量，為 1 256.1 mg/L，明顯高于pH值為7.0時的乙酸產量；此后隨著pH值的增加，乙酸產量降低，pH值為9.0時，菌體被抑制生長。由此可見，起始pH值在7.5左右時，菌株ZY-3具有較好的生長狀態和產乙酸代謝的生理生化過程。

2.4.3不同碳源對菌株ZY-3生長及產酸的影響

無機鹽培養基中按3%質量分數分別添加葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖[CM（25]、淀粉、檸檬酸、甘露醇、甘油、丙酸鈉、丁酸鈉10種碳源進行發酵試驗。由圖5可見，當碳源為麥芽糖時，菌株ZY-3的菌體濃度最大，乙酸產量最高，為1 346.7 mg/L；其次為葡萄糖，乙酸產量為1 204.9 mg/L；檸檬酸、甘露醇、甘油等底物不利于菌株ZY-3的代謝產酸。另外菌株ZY-3能以丙酸鈉、丁酸鈉為唯一碳源發酵產乙酸，對解除厭氧消化過程中由于丙酸積累所導致的系統酸化問題具有積極意義。

2.4.4耐鹽性研究

由圖6可見，加入一定量的Na+雖然菌體濃度有一定的降低，但是卻刺激了代謝產物乙酸的產生；隨著Na+濃度的增加，菌體濃度有所下降，在0.8 mol/L時已經幾乎被抑制；乙酸產量卻在Na+濃度為0.4 mol/L時達到最大值1 588.7 mg/L，比對照提高20.8%。說明適當濃度的Na+可以刺激代謝產物乙酸的產生。

3討論

與好氧技術相比，高濃度有機廢水的厭氧生物處理效率更高、運行成本更低、剩余污泥少，且能生成甲烷。近年來，國內[CM（25]外針對有機廢水厭氧消化水解產酸階段的研究越來越多。[CM）]

[TPXYH6.tif]

強化產乙酸菌群的產乙酸作用，解除大量丙酸的積累，成為目前廢水厭氧處理技術的研究熱點之一。本研究從污水處理廠活性污泥中分離得到的菌株ZY-3（雙酶梭菌，Clostridium bifermentans），具有較高的耐鹽能力，能分解麥芽糖、蔗糖、淀粉等多種底物產乙酸。同時還能利用丙酸鹽、丁酸鹽等產乙酸，對解除有機廢水厭氧消化過程中大量丙酸積累所造成的系統酸化有一定的積極意義。菌株ZY-3的發現拓寬了厭氧發酵產乙酸菌的范圍，為有機廢水厭氧消化處理的生物強化手段提供了寶貴的菌種資源，為進一步研制微生物強化菌劑提供了物質基礎，具有較高的潛在應用價值。

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