一步法制備大腸桿菌BL21（DE3）菌株感受態細胞及轉化條件優化

張跡++李智++張宇++袁巧云

摘要：大腸桿菌BL21（DE3）菌株是大腸桿菌表達系統最常用的宿主菌株，因此人們需要1種便捷有效的感受態細胞制備和轉化方法。一步法感受態細胞制備操作方便，只加1種試劑即可，更快捷穩定，轉化也更方便，不需要熱激。研究大腸桿菌感受態細胞一步法制備對BL21菌株的適用性，并對轉化過程中的關鍵參數進行探索和優化。結果表明，該一步法制備的BL21菌株感受態細胞可獲得106 CFU/μg DNA轉化效率，完全能夠滿足常規轉化要求。轉化過程中相關參數的最佳條件為冰水浴30 min，室溫放置10 min，37 ℃、150 r/min振蕩復蘇40 min。

關鍵詞：感受態細胞制備；一步法；大腸桿菌BL21（DE3）菌株；轉化條件

中圖分類號： X172文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0529-03

收稿日期：2015-11-04

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：31300099）；江蘇省高等學校大學生創新訓練計劃（編號：201310323046X）。

作者簡介：張跡（1982—），男，江蘇宿遷人，博士，講師，主要從事環境污染物微生物降解及污染環境微生物修復研究。E-mail：zhangjihnu@163.com。

在分子生物學試驗中，DNA重組技術和外源基因的表達是最常用的研究手段之一，質粒轉化進入大腸桿菌感受態細胞是其頻繁使用的一項基本操作技術。這項技術分為2個部分，即大腸桿菌感受態細胞的制備和質粒DNA的轉化。目前，制備感受態細胞最常用的方法是CaCl2法[1-2]和電穿孔法[3]。電轉化法轉化效率高，但是需要一套特殊儀器，操作過程也很繁瑣；CaCl2法不需要特殊儀器，操作簡便，重復性好，但耗時較長[4]。1989年Chung等報道了一步法制備大腸桿菌感受態細胞，該法操作簡便、快捷、重復性好，獲得單位質量轉化效率達到107～108個/μg單位質量的轉化子，能夠滿足常規試驗要求，并可在-70 ℃下長期保存。一步法感受態細胞制備及其轉化法適用于DH5α、HB101、JM109等多個大腸桿菌常用菌株[5]。

大腸桿菌表達系統是目前最常用的外源蛋白表達系統[6]，而大腸桿菌BL21（DE3）菌株是該表達系統最常用的宿主菌株[7]，需要便捷有效的感受態細胞制備和轉化方法。本研究采用一步法制備大腸桿菌BL21菌株的感受態細胞，研究該方法對BL21菌株的適用性，并對轉化過程中的關鍵參數進行探索和優化。

1材料與方法

1.1菌株與質粒

供試菌株：大腸桿菌BL21（DE3）菌株，由筆者所在實驗室保存。

供試質粒：PUC19（2 686 bp）、pET29a（5 371 bp）、pET29a-gfp（5 948 bp）。

1.2試劑

質粒抽提試劑盒，購自愛思進生物技術（杭州）有限公司；IPTG、X-GaL、PEG3350、相關抗生素，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。其他常規試劑均為國產分析純。

1.3主要培養基和溶液配方

LB培養基（1 L）：蛋白胨（Tryptone，OXCID）10.0 g；酵母提取物（Yeast extract，OXCID）5.0 g；NaCl 5.0 g；用去離子水補足1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。配制固體培養基時加入2%瓊脂。

轉化與貯存溶液（TSS）：液體LB培養基調pH值為6.5，含10% PEG3350，5%二甲基亞砜（DMSO），10%甘油，MgCl2 10 mmol/L，MgSO4 10 mmol/L，高壓蒸汽滅菌。

5×KCM溶液：KCl 0.5 mol/L，CaCl2 0.15 mol/L，MgCl2 0.25 mol/L。該溶液僅需少量配制（以mL計），過濾除菌，分裝成小份于-20 ℃保存備用，可反復凍融。

1.4大腸桿菌BL21菌株一步法感受態細胞的制備

制備方法參照文獻[5]所介紹的一步法。活化大腸桿菌BL21菌株，從37 ℃培養過夜的新鮮LB平板中挑取BL21單菌落，接種到3 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養過夜；取1 mL過夜培養菌液接種入100 mL液體LB培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養至D600 nm=0.3～0.5（約3 h）；將培養液轉移到滅菌的50 mL離心管中，置冰上10 min；4 ℃、6 000 r/min離心5 min，棄上清；用10 mL預冷的無菌TSS重懸菌體細胞；冰上放置10 min，分裝120 μL/管（在冰上操作），-70 ℃保存備用。

1.5大腸桿菌一步法感受態細胞轉化

取無菌的1.5 mL離心管，加入1 μL待轉化質粒，5×KCM 10 μL，ddH2O 39 μL，置冰上；從-70 ℃冰箱中取出大腸桿菌BL21菌株感受態細胞，立即融化；吸取50 μL感受態細胞加入上述離心管中，輕輕吹吸使之與上述試劑混勻，冰水浴20 min，室溫放置10 min；加入500 μL新鮮液體LB培養基，于37 ℃、150 r/min搖床中，振蕩復蘇40～50 min；室溫、 6 000 r/min 離心3 min，棄部分上清，留取約200 μL，重懸后涂布抗生素平板，37 ℃過夜培養，觀察平板，計數轉化子數，并計算轉化率。

轉化率=感受態細胞轉化后形成的菌落數（CFU）/DNA質量（ecg）。

轉化所用質粒均采用質粒提取試劑盒并按其說明書要求步驟操作，提取的質粒樣品經適度稀釋后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據其條帶亮度與標準的marker條帶比較并估算質粒濃度。

1.6轉化過程中的參數處理

在大腸桿菌BL21菌株感受態細胞轉化過程中，分別設置冰水浴時間（0、5、10、20、30、40、50 min）、室溫放置時間（0、5、10、20、30、40、50 min）、復蘇過程中的搖床轉速（0、50、100、150、180、200 r/min）及復蘇時間（0、5、10、20、30、40、50 min）等一系列不同的參數，研究這些參數對轉化效率的影響，探索大腸桿菌BL21菌株一步法感受態細胞的最優轉化條件。此外，為研究感受態細胞轉化后于4 ℃放置對轉化效率的影響，將感受態細胞在最佳條件下轉化并復蘇后，涂布抗生素平板，并于4 ℃保存，定時取平板（0、2、12、24 h），37 ℃ 過夜培養后分析計算轉化效率。以上所有處理均設置3個重復，取平均值，用Excel作圖，圖中的誤差線均表示標準差。

2結果與分析

2.1不同質粒對BL21菌株一步法感受態細胞的轉化

本研究分別使用大小不同的PUC19、pET29a、pET29a-gfp質粒對BL21菌株一步法感受態細胞進行轉化試驗，以探討大腸桿菌感受態細胞一步制備法對BL21菌株的適用性。轉化結果表明，3種不同大小的質粒均對大腸桿菌BL21菌株一步法制備的感受態細胞成功地實現了轉化；其中分子量較小的質粒pUC19所獲得的轉化效率最高，超過5×106 CFU/μg，分子量較大的質粒pET29a和pET29a-gfp獲得的轉化效率約為3×106 CFU/μg，略低于pUC19（圖1）。

pET系列載體是常用的大腸桿菌表達載體，含有T7強啟動子，廣泛應用于在大腸桿菌BL21菌株中誘導表達目的蛋白[8-9]。結果表明，pET29a和pET29a-gfp成功地轉化入BL21菌株的一步法感受態細胞，并在本研究的試驗條件下能獲得約 106 CFU/μg 的轉化效率，表明一步法制備的大腸桿菌BL21菌株感受態細胞完全能夠滿足常規重組表達載體轉化的要求。

2.2冰水浴時間對轉化效率的影響

在對大腸桿菌BL21菌株一步法感受態細胞的轉化過程中，設置不同的冰水浴時間。圖2表明，前30 min隨著冰水浴時間的延長，感受態細胞的轉化效率越來越高，在冰水浴30 min時表現出最高轉化效率，達到5.4×106 CFU/μg，之后轉化效率有所下降。因此，將轉化過程中的冰水浴時間設置為30 min最好。

2.3室溫放置時間對轉化效率的影響

大腸桿菌一步法感受態細胞轉化過程中，在冰水浴結束后將轉化體系直接放置在室溫中以替代傳統CaCl2法的熱休克步驟。為研究室溫放置時間對轉化效率的影響，本研究設置一系列不同的室溫放置時間。圖3顯示：本組試驗中室溫放置10 min時，獲得最高的轉化效率達到7.5×106 CFU/μg；室溫放置時間不足10 min時，轉化效率隨室溫放置時間延長而逐漸提高；放置時間超過10 min時，轉化效率則逐漸降低。因此，在室溫中放置10 min是大腸桿菌BL21菌株一步法感受態細胞轉化中該參數的最適條件。

2.4復蘇時間對轉化效率的影響

復蘇是大腸桿菌轉化過程中的重要步驟，大腸桿菌在此過程中將修復感受態細胞制備時留下的損傷，用于轉化子篩選的抗生素抗性基因在此過程中也得到了初步表達。為了研究一步法感受態細胞轉化的適宜復蘇時間，本研究按照 10 min 的時間間隔設置了6個復蘇時間。圖4表明：隨著復蘇時間的延長，轉化效率逐步提高，至復蘇40 min時轉化效率達到最高值；復蘇時間為50 min時，轉化效率較復蘇30、40 min 時有所降低。因此，40 min是大腸桿菌BL21菌株一步法感受態細胞轉化的最適復蘇時間。

2.5復蘇轉速對轉化效率的影響

復蘇過程中搖床振蕩的轉速對大腸桿菌轉化的效率有明顯影響。為研究大腸桿菌BL21菌株一步法感受態細胞轉化過程中最適的轉速，本試驗設置了6組不同的復蘇轉速，圖5顯示：復蘇轉速在0～150 r/min時，隨著轉速的增加，轉化的效率逐漸增高；轉速為150 r/min時轉化效率最高，達到 4.5×106 CFU/μg；復蘇轉速超過150 r/min之后，轉化效率開始逐漸下降。因此，150 r/min是大腸桿菌BL21菌株一步法感受態細胞轉化的最適復蘇轉速。

在研究復蘇轉速對轉化效率影響的試驗過程中，由于使用同一臺搖床設置不同轉速，因此本試驗不同處理的轉化過程就存在先后。為保證所有的處理組同時培養，將先轉化的菌體細胞涂布抗生素平板后于4 ℃冰箱中放置，待本試驗所有處理全部轉化結束后一同放入37 ℃培養箱培養。然而，在本試驗過程中偶然發現相同的重復平板在4 ℃放置后轉化子數明顯比未在冰箱中放置過的多，所以重新做了復蘇轉速的試驗，以避免4 ℃冰箱中放置對試驗結果的影響，同時又對 4 ℃ 冰箱中放置時間對大腸桿菌轉化效率的影響進行研究。

2.64 ℃冰箱中放置時間對轉化效率的影響

之前的研究發現，轉化后涂布的抗生素篩選平板在放入培養箱培養之前，于4 ℃冰箱中放置一段時間對最終的轉化效率會產生一定的影響。圖6表明：抗生素篩選平板在4 ℃冰箱中放置一段時間，長出的轉化子數明顯比未在冰箱中放置過的多，冰箱中放置2 h轉化效率最高，在冰箱中放置12、24 h的轉化效率明顯下降，但仍比未在冰箱中放置過的高。

3討論

目前，生命科學研究領域的分子生物學試驗技術高度發展[CM（25]，并被廣泛應用。感受態細胞的制備和轉化是其中的一項基本操作，其主要方法有化學轉化法[1-2]和電轉化法[3]。最常用的化學法是CaCl2法，此外，大腸桿菌感受態化學制備方法還有甘油-聚乙二醇法[10-11]、氯化銣法[12]和一步制備法[5，13]。大腸桿菌感受態細胞制備一步法操作便捷，其轉化也較方便，適用于DH5α、HB101、JM109等多個大腸桿菌常用菌株。大腸桿菌感受態細胞的轉化效率除了與其制備方法和菌株有關外，還與其凍存條件以及轉化過程密切相關[14-16]。

本研究采用一步法制備的大腸桿菌BL21菌株的感受態細胞可獲得106～107 CFU/μg的轉化效率，完全能夠滿足常規轉化試驗的要求。同時該結果也表明，一步法可用于大腸桿菌BL21菌株感受態細胞制備。為探討和優化BL21菌株一步法感受態細胞轉化過程中的關鍵參數條件，本研究在參照傳統感受態細胞轉化步驟的基礎上分別設置冰水浴時間、室溫放置時間、復蘇過程中的搖床轉速以及復蘇時間等一系列不同的參數。

轉化條件優化試驗結果表明，大腸桿菌BL21菌株一步法感受態細胞的最優轉化條件：轉化體系先冰水浴30 min，然后取出樣品置于室溫中放置10 min，加入適量新鮮LB培養基后置于37 ℃、150 r/min搖床中振蕩復蘇40 min，涂布抗生素平板，37 ℃過夜培養篩選轉化子。

在轉化試驗中，筆者發現轉化體系涂布抗生素平板后置于4 ℃冰箱中放置一段時間，長出的轉化子數明顯比未在 4 ℃ 冰箱中放置過而直接于37 ℃培養箱中過夜培養的多，且重復幾次試驗均得到類似結果。為此，筆者做了一組轉化試驗，并設置了一系列不同的4 ℃冰箱放置時間。結果顯示，在4 ℃冰箱中放置2 h轉化效率最高，在冰箱中放置12、24 h的轉化效率又有所下降，但仍比未在冰箱中放置過的高。筆者目前對于出現這一試驗結果的原因尚未十分明了，還需要進一步研究和分析。

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