擁擠脅迫對已接種疫苗的大菱鲆部分免疫和應激指標的影響

殷述亭， 劉寶良， 黃 濱， 霍歡歡， 王蔚周 順

(1 青島農業大學海洋科學與工程學院，山東 青島266109；2 中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島266071)

擁擠脅迫對已接種疫苗的大菱鲆部分免疫和應激指標的影響

(1 青島農業大學海洋科學與工程學院，山東 青島266109；2 中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島266071)

通過對3個養殖初始密度(低、中、高密度組分別為5、10、20 kg/m2)的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)接種減毒遲緩愛德華氏菌疫苗，觀察其血液、脾臟、頭腎、鰓和皮膚中部分免疫和應激指標的變化規律，研究經接種疫苗操作后大菱鲆應對擁擠脅迫的應激響應。結果顯示，低密度養殖的白細胞介素(1L-1β)、補體(C3)、免疫球蛋白M(IgM)、溶菌酶(LZM)和腫瘤壞死因子(TNF -α)等免疫指標顯著高于中、高密度組(P<0.05)，高密度組血液中皮質醇的含量高于中、低密度組(P<0.05)；通過基因表達分析發現，高密度組的熱休克蛋白(HSP70)表達量顯著高于中、低密度組；低密度組的免疫球蛋白M(IGM)表達量高于中、高密度組。研究表明，為提高大菱鲆的免疫效果、減少應激反應，可以采用低密度(5 kg/m2)養殖。

大菱鲆；遲緩愛德華氏菌疫苗；擁擠脅迫；血清指標；基因表達

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)屬于硬骨魚綱，鰈形目鲆科，原產于歐洲大西洋海域，是世界市場公認的優質比目魚類之一[1]，自1992年被引入我國后，迅速成為我國北方沿海省份主要養殖經濟魚類之一。近年來，伴隨養殖規模的不斷擴大，病害問題時有發生，影響了產業的健康發展。目前，我國對于水產動物的病害防治仍然以化學防治為主，因此，抗生素類藥物被大量使用，導致環境污染，所引發的食品安全問題受到社會各界的關注。

遲緩愛德華氏菌屬于腸桿菌科的愛德華菌屬(Edwardsiella)，是繼鰻弧菌后又一種給我國水產養殖業帶來巨大經濟損失的病原菌[2-4]。魚用疫苗是一種能夠激發魚體產生自動免疫的生物制劑，可以利用疫苗技術有效預防遲緩愛德華氏菌病。但是，疫苗的使用效果受免疫策略的影響。有研究表明，不同水溫對已接種草魚輪狀病毒疫苗的草魚免疫力影響顯著[5]；不同佐劑的疫苗對大鯢的免疫力能產生不同的影響[6]；注射、口服免疫菌蛻疫苗對羅非魚均能產生免疫效果[7]。目前，關于擁擠脅迫對接種疫苗免疫力的影響相關報道還很少，因此有必要明確兩者之間的關系。

擁擠脅迫作為一種常見脅迫因子，可導致免疫相關蛋白和基因變化。據報道[8]，擁擠脅迫降低塞內加爾鰨機體免疫功能。相似的研究結果在金頭鯛、虹鱒和羅非魚的研究中也有報道[9-11]。此外，擁擠脅迫也會引起免疫球蛋白M基因和熱休克蛋白(HSP70)基因表達的變化。本研究是在工廠化循環水養殖中對大菱鲆接種已減毒遲緩愛德華氏菌疫苗，比較不同養殖密度對大菱鲆同一時間點的部分免疫指標及應激指標的變化情況，確定對大菱鲆免疫力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

所用大菱鲆飼養于煙臺市山東東方海洋科技股份有限公司開發區分公司的循環水養殖系統中。該系統有3個水池，每個水池體積3 m3，均采用(150±10)g、健康以及體表無損傷的大菱鲆，實驗采用的疫苗來自華東理工大學張元興教授實驗室[12]。

1.2 實驗設計與日常管理

實驗設置低、中、高3個密度組，分別為5、10和20 kg/m2，每個密度組設置1個空白對照組。每個密度組設置 3 個重復。每天8:00和16:00進行投喂，日投喂量為體質量的1.2%左右，根據攝食情況和大菱鲆的體重變化隨時調整。水循環速率為24次/天，日換水量為100%。實驗魚在系統中暫養半個月后開始注射疫苗，注射時將魚撈出后用MS-222進行麻醉，對實驗組進行腹腔注射減毒疫苗，對照組則注射等量的生理鹽水。

1.3 樣品采集

共進行9次取樣，第1次取樣是注射疫苗前的第1天，第2次取樣為注射疫苗后的第1周，以后每周取樣1次。取樣前將大菱鲆置于200 mg/L的MS-222中做深度麻醉，避免對魚的刺激。每次取樣5尾魚，用注射器取尾靜脈血3 mL，放入5 mL離心管中保存，每個注射器內加入0.5 mL的肝素鈉作為抗凝劑，4℃冰箱過夜，用轉速12 000 r/min離心30 min，取上清液放到凍存管中，-80℃冰箱保存備用。取抽完血的魚的肝臟、脾臟、頭腎、腸、鰓和皮膚，用遇冷的生理鹽水漂洗去血液，減去組織表面的結締組織，用剪刀將其剪成1 mm大小放入凍存管中，將凍存管放入液氮中暫時保存，后轉入-80℃冰箱長期保存，以便日后用于RNA提取。

1.4 水質與血液免疫指標測定

1.5 基因表達

利用RNA快速提取試劑盒(寶生物工程〈大連〉有限公司)提取脾臟、頭腎、鰓和皮膚組織的總RNA，提取方法按試劑盒說明書操作。使用反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara Dalian,China)將提取的總RNA反轉錄為cDNA，放置于20μL的RNAse free dH2O中，在-80℃冰箱中保存待用。

本實驗所用的引物通過Genbank相關基因設計。所有引物由上海生物工程有限公司合成，按照使用說明進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)反應。采用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法進行實時定量PCR擴增反應。每個反應取2μL cDNA、10μL的SYBR Prime Ex Taq ，反應條件為：95℃3 min，然后40個循環(95℃15S，57℃60S，讀板記錄熒光量)，最后72℃3 min。以β-actin為內參，對得到的各樣品Ct值進行均一化處理，以低密度組的值為基準，應用2-ΔΔCt法[16]分析實驗組中的基因相對表達量。

1.6 數據處理

2 結果

2.1 水質參數的變化

整個實驗過程中DO、T、pH和鹽度相對穩定，分別維持在(8±0.5)mg/L、 (18±1)℃、(7.5±0.3)和(28±1)。實驗組和對照組之間沒有顯著性差異。氨氮、亞硝酸鹽和可溶性磷酸鹽的濃度和COD有略微上升的趨勢，但實驗組和對照組之間沒有明顯差異，不同密度組之間也沒有明顯差異(圖1)。

2.2 接種疫苗后不同密度組大菱鲆血清免疫和應激指標的變化

2.2.1 對白細胞介素1β(1L-1β)的影響

在接種疫苗前，實驗組和對照組中不同密度組大菱鲆的1L-1β水平差異不顯著，接種操作后，實驗組中的高密度組大菱鲆的1L-1β濃度迅速升高，達到峰值后開始下降并趨于平穩，而低密度組的1L-1β的濃度在第2周達到峰值后開始下降直至趨于平穩；對照組中的中、高密度組呈現相對平穩的趨勢，低密度組呈現先相對平穩后上升的趨勢(圖2A)。結果顯示，在實驗組中，自第2周起低密度組中的1L-1β濃度顯著高于其它組；在對照組中，自第8周起低密度組的1L-1β的濃度明顯高于其它密度組(P<0.05)。

圖1 養殖密度對大菱鲆水質指標的影響

圖2 擁擠脅迫對血液免疫指標的影響

2.2.2 對已免疫大菱鲆補體C3的影響

接種疫苗之前，實驗組和對照組中的不同密度組大菱鲆補體C3濃度無顯著差異，接種操作后，實驗組各密度組中C3濃度均顯著升高，在第3周達到峰值并緩慢下降，趨于平穩；對照組中的C3濃度呈現相對平穩的趨勢(圖2B)。結果顯示，自第2周起，實驗組中的低密度組大菱鲆C3濃度顯著高于其它組(P<0.05)；對照組未出現明顯差異。

2.2.3 對已免疫大菱鲆總免疫球蛋白M(IgM)的影響

接種疫苗之前，實驗組和對照組中不同密度組大菱鲆總IgM的濃度差異不顯著，接種操作后，實驗組中各密度組的IgM濃度均顯著升高，在第2周達到峰值后并緩慢下降，趨于平穩，對照組中、高密度組的IgM呈現一個相對平穩的趨勢，低密度組先呈現相對平穩，后上升的趨勢(圖2C)。結果顯示，在實驗組中，自第2周起低密度組中大菱鲆的總IgM濃度顯著高于其它組(P<0.05)；對照組未出現明顯差異。

2.2.4 對已免疫大菱鲆溶菌酶(LZM)的影響

接種疫苗之前，實驗組和對照組的不同密度組中大菱鲆LZM濃度差異不顯著，接種操作后，實驗組中各密度組的LZM濃度均顯著升高，中、高密度組在第2周達到峰值后開始緩慢下降，最后趨于平穩，而低密度組在第3周達到峰值后緩慢下降，后趨于平穩；對照組呈現相對平穩趨勢(圖2D)。結果顯示，自第3周起，低密度組中大菱鲆的LZM濃度顯著高于其它組(P<0.05)；對照組中未出現明顯差異。

2.2.5 對已免疫大菱鲆腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響

接種疫苗之前，實驗組和對照組不同密度組中的大菱鲆TNF-α的濃度差異不顯著，接種操作后，實驗組中各密度組的TNF-α濃度均顯著升高，在第3周達到峰值后開始緩慢下降，最后趨于平穩；對照組則呈現相對平穩的趨勢(圖2E)。結果顯示，自第3周起，實驗組中低密度組大菱鲆的TNF-α濃度顯著高于實驗組中的其它組(P<0.05)，對照組中未出現明顯差異。

2.2.6 對已免疫大菱鲆皮質醇(Cortisol)的影響

接種疫苗之前，實驗組和對照組中的不同密度組中大菱鲆皮質醇濃度的差異不顯著，接種操作后，實驗組中各密度組的皮質醇濃度均呈現先上升后下降，最后都趨向平穩，低密度組在第2周達到峰值后緩慢下降，中、高密度組在第4周達到峰值后開始下降；對照組中低密度組呈現相對平穩的趨勢，中、高密度組呈現先保持相對平穩后上升的趨勢(圖2F)。結果顯示，在實驗組中，自第3周起，中、高密度的皮質醇濃度顯著高于低密度組；在對照組中，自第7周起低密度組皮質醇濃度顯著低于中、高密度組(P<0.05)。

2.3 已免疫大菱鲆的部分免疫基因和應激基因表達量的變化

2.3.1 熱休克蛋白基因(HSP70)的變化

接種疫苗前，實驗組和對照組的各組織間的IgM表達量差異不顯著；接種操作后，實驗組各密度組的組織表達量均呈現先升高后降低最后趨于平穩的趨勢(圖3A,C,D)。

在第2周以后，脾臟、鰓和皮膚中IgM基因表達量達到最大值后開始下降(圖3A,C,D),在第3周后，頭腎的IgM表達量達到最大值后開始下降(圖3B)。對照組中除低密度組中的頭腎組織表達量自第7 周起IgM的表達量出現一個上升外，其它各密度組的各個組織均呈現一個相對平穩的趨勢(圖3A,B,C,D)。統計分析結果顯示，自第2周起，實驗組中低密度組的顯著高于同期中密度組，而中密度組的又顯著高于同期的高密度組；對照組中、低密度組的頭腎組織，自第七周起顯著高于頭腎組織中、高密度組的IgM表達量外，其它組織均為出現顯著的差異 (圖3A,B,C,D，P<0.05)。

2.3.2 免疫球蛋白M基因(IgM)的變化

接種疫苗前，實驗組和對照組不同組織HSP70的表達量差異不顯著，接種操作后，實驗組中的各個密度組各個組織的HSP70表達量均呈現先上升后下降，最后穩定的趨勢，對照組的各密度組呈現相對平穩的趨勢(圖4A,B,C,D)。統計結果顯示，實驗組中各密度組在頭腎、脾臟和鰓的表達量在第2周后，高密度組顯著高于同期中、低密度組的HSP70表達量(圖4A,B,C，P<0.05)，而在皮膚中的表達量在第3周后，高密度組顯著高于同期中、低密度組的HSP70的表達量(圖4D，P<0.05)；對照組間未出現顯著差異(圖4A,B,C,D，P<0.05)。

圖3 擁擠脅迫對IgM相對表達量的影響

圖4 擁擠脅迫對HSP70相對表達量的影響

3 討論

3.1 水質變化對大菱鲆免疫指標的影響

3.2 擁擠脅迫對接種疫苗后大菱鲆血清免疫和應激指標的影響

有研究表明，擁擠脅迫會對魚類的免疫機能產生影響[21-22]。血液中含有多種免疫物質，如1L-1β、LZM、IgM、補體C3和TNF-α等，在抵御物理、化學和生物等因素脅迫中具有非常重要的作用[23]。

補體在魚類抵抗微生物感染過程中扮演這重要角色，啟動后能夠參與機體靶細胞溶解和調理反應，其中補體C3是補體系統最主要的成分之一，激活后具有溶血、溶菌、調理、免疫吸附等生物學功能[24]。擁擠脅迫對黃姑魚補體C3的影響差異不顯著[25]；而在施氏鱘稚魚中，隨養殖密度的逐漸增大，補體C3呈現減少的趨勢[26]。這同本實驗的結論一致。不同密度組大菱鲆經免疫刺激2周后，補體C3隨密度的逐漸增大而減少。同時，本實驗中大菱鲆血清補體C3濃度在免疫達到峰值的時間與聶芬[26]研究黃顙魚補體C3濃度達到峰值的時間相同。因此，可以推測擁擠脅迫能夠通過降低大菱鲆補體C3的濃度，進而影響降低大菱鲆的免疫力。

IgM是魚類最主要的免疫球蛋白，是當機體受到抗原刺激后最先產生的抗體，具有很強的細胞毒活性和細胞溶解活性。IgM廣泛應用于評估魚類的免疫水平，是由相關的免疫球蛋白基因產生的。本實驗發現，第1周IgM在血清中及部分組織表達量達到峰值，這與李桂歡[28]研究羅非魚以及王玉娟[17]研究大菱鲆的結果相類似，而Vargas-Chacoff等[29]對智利亞南極魚研究發現，在高密度(60 kg/m3)養殖條件下，IgM濃度和低密度(3.1 kg/ m3)條件下并沒有差異。但在本研究中，當大菱鲆養殖密度達到20 kg/m2時，免疫球蛋白的濃度顯著降低。因此，擁擠脅迫能通過影響IgM的表達量來影響IgM的濃度，使高密度組大菱鲆的免疫力降低。

LZM廣泛存在于生物體液、血清和巨噬細胞中，在抵御外來病原菌方面發揮著重要作用，其活性在一定程度上能說明魚非特異性免疫的體液免疫狀態，也能水解革蘭氏陽性菌的細胞壁，使內容物逸出進而起到殺菌的作用[30]。Demers等[31]對虹鱒的研究發現，隨著養殖密度的升高，LZM水平顯著升高。而本研究結果則顯示低密度組的LZM水平顯著高于中、高密度組，這同俄羅斯鱘幼魚應對不同密度脅迫時LZM應答規律[32]相同。但在本研究中，接種疫苗后LZM出現急劇上升，同樣，與孫金輝等[33]研究虹鱒時發現LZM在第三周達到最大值的時間相類似。因此，擁擠脅迫能夠通過降低大菱鲆的LZM濃度，進而降低高密度組大菱鲆的免疫力。

1L-1β和TNF-α是兩種主要的促炎細胞因子。1L-1β能夠通過誘導炎癥反應效應細胞、相關組織細胞、淋巴細胞和血管內皮細胞生長發育而在炎癥中發揮著作用，并且具有調節代謝、造血和免疫學活性等功能[34]；TNF-α是當病原入侵時，由巨噬細胞或者是單核細胞產生的炎癥細胞因子，能夠直接殺死腫瘤細胞，還在細胞間的信號傳導中發揮作用[35]，在抵御寄生蟲和病原微生物中充當介質，同時在機體內發揮著治療作用[36-38]。有研究表明，急性擁擠脅迫以顯著誘導1L-1β和TNF-α基因表達上調，這可能和皮質醇濃度上調有關[39-40]，但長期的密度脅迫可導致1L-1β和TNF-α基因表達下調[10]，這與本研究結果相似。本實驗中，大菱鲆接種疫苗后，1L-1β和TNF-α的濃度快速升高并達到最大值，這與幼齡大馬哈魚接受殺鮭氣單胞菌疫苗進行腹腔免疫時，魚體腎臟和脾臟中1L-1β和TNF-α基因的表達規律相類似[41]。因此，擁擠脅迫能夠通過抑制1L-1β和TNF-α的基因表達，影響這兩種促炎細胞因子濃度，進而導致高密度組免疫力降低。

3.3 擁擠脅迫對接種疫苗后大菱鲆血清皮質醇濃度的影響

皮質醇是一種重要的應激激素，其由丘腦下部—垂體—腎間組織軸所分泌[42]，其上升是被看成魚類應激的靈敏信號[43]。因此，血清皮質醇水平可作為評價魚類應激反應的一個重要指標。國內外很多學者對血清皮質醇濃度進行了大量研究。如：擁擠脅迫對緣石脂鯉的血漿皮質醇濃度并沒有產生影響[44]；擁擠脅迫使鯽魚血液皮質醇濃度在幾天內顯著升高，隨后雖有下降但高密度組一直保持較高濃度[45]；高密度養殖虹鱒的皮質醇濃度會明顯高于低密度組的皮質醇濃度[46]；牙鲆研究中也發現相同的規律[47]。本實驗中發現接種疫苗初期大菱鲆皮質醇濃度上升，這與張意敏等[48]研究羅非魚的實驗結果相同。因此推測，這主要是因為皮質醇是一種快速響應的應激激素，接種操作對大菱鲆的應激刺激效應隨著時間推移已經不顯著，而養殖密度造成的慢性擁擠脅迫逐漸體現出來，導致高密度組皮質醇濃度高于其它組，這類似于虹鱒中的研究發現[46]。因此，擁擠脅迫能夠使魚長期處于應激狀態，導致魚體免疫力下降。

3.4 擁擠脅迫對接種疫苗后大菱鲆部分免疫基因和應激基因表達量的影響

HSPs主要作為分子伴侶參與蛋白質折疊、組裝、降解以及細胞內定位，在魚類中HSP70是研究最廣泛的熱休克蛋白之一，其在正常情況下就可以進行表達，在溫度、鹽度、低氧、滲透壓以及微生物感染等環境因子的脅迫下，其表達量就會顯著增加[49]。本研究結果顯示，大菱鲆接種疫苗后，HSP70表達量在第一天就出現了急劇上升，這同先前于大菱鲆中研究結論[50]相同；養殖到第2周時低密度與中高密度出現了明顯差異，這與在海鱸和施氏鱘的研究結果[51-52]相類似。擁擠脅迫能夠通過降低HSP70的基因表達量，進而影響大菱鲆的免疫力。

4 結論

各個養殖密度組在注射疫苗后，經過2個月的養殖，高密度組能夠引起各血液免疫指標發生不利的變化，低密度組的IgM、LZM、1L-1β、TNF -α和C3濃度高于中、高密度組，而皮質醇的濃度高密度組則顯著高于低密度組。通過基因表達分析顯示，高密度(20 kg/m2)引起脾臟、頭腎、鰓和皮膚組織中的免疫相關基因表達，高密度組HSP70免疫基因表達量明顯高于中、低密度組；低密度組(5 kg/m2)的IgM表達量明顯高于中(10 kg/m2)、高密度組(20 kg/m2)。研究表明，擁擠脅迫降低了大菱鲆的免疫能力，在低密度下養殖，大菱鲆的免疫能力較好。

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Effects of crowding stress on immunity and stress index of turbot injected with vaccine

YIN Shuting1,2，LIU Baoliang2，HUANG Bin2，HUO Huanhuan2，WANG Weifang2，LEI Jilin2，ZHOU Shun1

(1MarineScienceandEngineeringCollege,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266109China;2YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071,China)

In this study,the responses of turbots to crowding stress were studied though obverting the changes of immune and stress index in blood,spleen,head kidney,gills and skin before and after being inoculated with attenuatedEdwardsiellatardavaccine,using turbots cultured in different initial stocking densities (low density:5 kg/m2,medium density:10 kg/m2,high density:20 kg/m2).The results showed that:the immune indexes such as serum interleukin (1L-1β),complement (C3),immunoglobulin M (IgM),lysozyme (LZM) and tumor necrosis factor (TNF-α) of turbots in the low density group were significantly higher than those of the medium and high density groups (P<0.05);the blood cortisol level of turbots in the low density group was significantly higher than that of the medium and low density groups (P<0.05);heat shock protein (HSP70) gene expression in the high density turbots was significantly higher than that of the medium and low density groups;and,immunoglobulin M (IgM) expression in low density turbots was higher than that of the medium and high density groups.Above all,in order to improve the immune effect and reduce stress response of turbot,it is suggested to adopt low density (5 kg/m2) breeding system.

Scophthalmusmaximus;Edwardsiellatardavaccine;crowding stress;serum immune index;gene expression

10.3969/j.issn.1007-9580.2017.01.006

2016-10-29

2017-01-18

國家自然基金項目(31402315)；國家鲆鰈類產業技術體系高效養殖模式崗(CARS-50-G10)；山東省現代農業產業技術體系創新漁業團隊項目(SDAIT-12-06)；青島市市南區科技計劃項目(2016-3-006-ZH)

殷述亭(1990—)，男，碩士研究生，研究方向：工廠化健康養殖技術。E-mail：yst0325@163.com

周順(1970—)，男，教授，研究方向：病害免疫與防治。E-mail：zs1123@sina.com

S942.5

A

1007-9580(2017)01-026-09