我國楊樹黑斑病研究進展

范學恒(遼寧省黑山縣林業局，遼寧 錦州 121400 )

我國楊樹黑斑病研究進展

范學恒
(遼寧省黑山縣林業局，遼寧 錦州 121400 )

楊樹黑斑病是一種危害較重的楊樹病害，受害楊樹光合速率下降并提前落葉，影響樹木的生長和營養儲備。我國學者對楊樹黑斑病開展了大量研究工作，在病原菌種類期專化型、寄主抗病性、植物-病原菌互作、分子生物學等方面成果顯著，本文就我國在楊樹黑斑病取得的相關進展進行了綜述，并對存在問題進行簡要分析。

楊樹；楊樹黑斑病；楊生褐盤二孢菌

楊樹黑斑病又稱楊樹褐斑病，是一種危害較重的楊樹葉部病害，能危害包括黑楊派、青楊派、白楊派及多種派間雜種楊樹的幼苗、幼樹及成年樹[1]，其中中林46等速生楊樹品種受害較重[2]。楊樹黑斑病分布于整個楊樹栽培區，在我國主要分布于吉林、遼寧、河北、河南、安徽、湖北、江蘇、云南，新疆等地[3]。受害楊樹光合效率下降并提早落葉，影響樹木生長和營養儲備[4]，造成楊樹年生長量減少25%～50%，年平均木材產量損失約30%[1]。

1 病原菌分類及專化型

楊樹黑斑病屬真菌性病害，曾有報道認為引起楊樹黑斑病的Marssonina屬真菌有十幾種[5]，Spiers根據分生孢子形態大小和分隔位置將歐洲和美洲286個楊樹黑斑病標本歸納為4個種2個專化型[6]，在我國引起楊樹黑斑病的病原真菌有3種，分別是白楊盤二孢菌(Marssoninacastagnei)、楊盤二孢菌(M.populi)和楊生褐盤二孢菌(M.brunneaf.sp.multigermtubi)。不同的病原菌引起的黑斑病癥狀在病斑位置、病斑形狀等方面不盡相同：楊盤二孢菌引起的黑斑病病斑呈圓形，中間為乳白色膠狀分生孢子堆，老葉上的病斑開始為黑褐色，以后病斑連接而后枯死。楊生褐盤二孢菌引起的黑斑病，先從葉背面產生針刺狀亮點，后擴大成黑色，中間產生乳白色分生孢子堆，病斑多時，相互連接成不規則的斑塊，使全葉變黑落葉。白楊盤二孢菌引起的楊樹黑斑病，在葉正面上形成近圓形的、暗褐色病斑。空氣潮濕時在病斑上產生一至多個乳白色小點，病斑數量多時連成不規則斑塊。

楊生褐盤二孢菌(M.brunnea)是引起楊樹黑斑病的主要致病病原，屬半知菌亞門(Deuteromycotina)、腔孢綱(Coelomycetes)、黑盤菌目(Melanconiales)、盤二孢屬(Marssonina)。在歐洲、美洲、大洋洲以及亞洲都有發現[7]，我國的楊生褐盤二孢菌，存在2種專化型[8-9]，依據對楊屬不同派別致病力不同及分生孢子萌發時產生的芽管數量不同劃分為單芽管專化型(M.brunneaf.sp.monogermtubi)和多芽管專化型(M.brunneaf.sp.multigermtubi)[5]。單芽管專化型，分生孢子萌發時產生一個芽管，在自然條件下以侵染白楊派樹種及其雜交種為主，對黑楊派及青楊派樹種致病性較低，在PDA培養基上其菌落顏色為深褐色，產生醬紅色的孢子堆。多芽管專化型分生孢子萌發時產生1～5個(通產2～3個)芽管，在自然條件下以侵染黑楊派樹種及其派內雜交種和黑楊派同青楊派的雜交種為主，在PDA培養基上其菌落顏色為淺白色或淺褐色，產生黃綠色的孢子堆。兩個專化型菌株之間不能發生菌絲融合，為兩個獨立的遺傳群體[5]。

韓正敏對我國江蘇、河南、山東、陜西、北京和吉林6個省區的不同楊樹上42個楊生褐盤二孢菌標本的分生孢子大小和形態、培養形狀、致病性方面的差異進行了比較和分析，兩個專化型在分生孢子大小及形態方面無顯著差異，但在培養特性及致病性方面存在較大不同。各菌株分生孢子均為倒卵形，雙細胞，兩細胞不等大，直或稍彎曲。菌株間分生孢子的長度、寬度和分隔位置不明顯，菌株間分生孢子大小和形態與菌株的地區來源和寄生來源均無明顯相關性[5]。

另外譚碧玥[10]利用芽管萌發技術觀察了M.brunnea分生孢子萌發過程中的有絲分裂過程，M.brunnea有絲分裂過程可以分為4個時期：前期染色質逐漸濃縮變短，中期可清楚觀察得到3條染色體，后期姐妹染色單體發生分離并分別向兩極移動，末期則可見子核的形成。同時確定Giemsa(吉姆薩染色)最適用于M.brunnea染色體觀察。

2 寄主抗性研究

賀偉、楊俊秀等人對白楊派、青楊派、黑楊派不同種源和不同無性系楊樹進行抗楊樹黑斑病測試，結果表明楊樹不同品系對黑斑病的抗性存在很大的差異。

賀偉[8]對3種楊樹黑斑病病菌的寄主范圍進行了細致研究，結合室內人工接種和田間自然發病調查結果，發現楊生褐盤二孢菌多芽管專化型能夠侵染供試的黑楊派、青楊派及兩個派間的雜交種；白楊派的毛白楊、銀白銀則為免疫樹種。單芽管專化型能侵染白楊派的山楊、毛白楊及胡楊派的胡楊，不侵染白楊派的銀白楊、新疆楊和黑楊派、青楊派及其派間雜種。楊盤二孢菌侵染箭桿楊和小葉楊，不侵染214楊、加楊、青楊白楊派和胡楊派樹種。白楊盤二孢菌侵染白楊派新疆楊、毛白楊、山楊和胡楊派的胡楊，不侵染銀白楊及黑楊派和青楊派的樹種。楊俊秀[11]對84K楊、新疆楊、河北楊、毛白楊14等7個白楊派優良無性系進行了抗黑斑病、葉枯病和銹病的抗性測定與評價，84K楊表現出高度抗性。 高建社[12]應用統計分析方法研究了22個不同種源和300個不同無性系青楊幼樹對楊樹黑斑病的抗病性，篩選出大通種源的14號無性系可以作為抗黑斑病育種材料。倪楊等[13]對黑楊無性系苗期對葉部病害抗病性進行了研究，篩選出140-31、17-89、02號楊、N-179楊和北抗楊對黑斑病免疫。周永學等[14]對引進的59個歐洲黑楊無性系苗期感染黑斑病進行調查，其中無性系N34，N13，N15等10個無性系對黑斑病表現出高度抗性。向玉英[15]在20世紀80年代通過室內抗病測試和田間試驗，篩選出抗黑斑病和干部潰瘍病的中林-115、中林379和中林34。

3 楊樹與黑斑病菌互作

研究寄主-病原物互作關系，有助于揭示寄主感病機制，揭示病害發生的規律。我國學者對楊樹與黑斑病菌互作方面的研究主要集中在生理生化、超微結構變化及分子生物學等方面[16]。

楊生褐盤二孢菌在侵染楊樹早期在葉片侵染位點會形成微小由胼胝體和木質素組成的乳突毛，侵染寄主之后釋放毒素和細胞壁降解酶造成寄主產生壞死病斑[17]，楊生褐盤二孢菌，主要參與茉莉酸信號傳導途徑，在茉莉酸和水楊酸處理后，兩個信號途徑相互抑制，即水楊酸途徑被激活的程度大，茉莉酸信號通路抑制明顯，從而表現為對黑斑病菌感病[18]。

植物表面氣孔密度和植物的蒸騰速率對病原真菌孢子的侵染成功率及孢子萌發有一定影響。但是黑楊派楊樹無論是抗病品種還是感病品種氣孔大小和密度與抗/感病性能毫無關系，而過氧化物酶明顯升高，說明病原菌菌絲或孢子可能產生誘導抗性的物質[19]。病原菌激發子可以激發寄主體內植保素積累和一系列抗病防衛反應，從而抑制或減輕病害的發生。國內外學者對病原菌激發子作了不少研究，水稻白葉枯病菌[20]、瓜類刺盤孢菌[21]等農業病害病原菌研究較多，而林業上的研究較少。研究表明，楊盤二孢菌存在激發子物質，梁偉紅從楊盤二孢菌中獲得CFE和CME兩種激發子物質，處理楊樹后發現抗病楊樹的酶活性變化較為明顯，POD、PAL的活性增強，且隨濃度的升高活性明顯提高。寄主植物與病原菌互作的早期常發生氧化暴發現象，氧化暴發是植物被病原體感染，發生過敏反應時產生和積累大量活性氧的現象。活性氧在后期防衛事件和互作關系的確定具有重要作用[22]。梁偉紅[23]對楊樹與楊盤二孢菌激發子互作進程中活性氧的釋放進行了研究，研究表明，抗病的I-72楊懸浮細胞活性氧的釋放表現出了氧化暴發現象，感病的加楊懸浮細胞活性氧釋放量一直處于較低水平。

隨著電子顯微鏡技術在楊樹葉銹病等多種病害上的成功應用，有關楊樹與楊樹黑斑病菌互作中的組織和細胞學研究逐漸開展起來。袁坤[16]利用掃描電鏡與透射電鏡對健康的“NL895”和感染黑斑病的加楊葉片進行了顯微觀察，發現未感染黑斑病病菌的葉片表皮細胞正常，可以清晰地看到氣孔，感染黑斑病的葉片表皮腫脹，孢子浮在葉片表面，且局部能看到菌絲體圍繞在氣孔周圍，初步推測菌絲體可能直接從氣孔侵入。楊樹黑斑病菌侵染楊樹葉片后導致葉肉細胞受損，細胞壁、葉綠體、線粒體、細胞核等超微結構發生變化，膜系統被破壞，同時細胞內嗜鋨顆粒增大、數量增多，細胞的能量代謝受到干擾，正常生理活動受到影響。

4 分子生物學研究進展

隨著楊樹全基因組測序及楊生褐盤二孢菌全基因組測序工作的完成[24]，利用分子生物學手段研究病原菌的致病機制以及楊樹抗黑斑病機制提供了新的思路，我國南京林業大學專家、學者在楊樹抗黑斑病分子標記、抗病基因篩選、基因表達分析等方面做出了突出貢獻。

張博[17]基于雙擬測交策略構建了美洲黑楊I-69×歐美楊I-45楊F1群體分子標記遺傳連鎖圖譜。母本I-69楊圖譜包括206個AFLP標記、164個SSR標記、83個RAPD標記、6個ISSR標記、2個SNP標記和1個性別分化標記。父本I-45楊圖譜包括153個SSR標記、142個AFLP標記、61個RAPD標記、10個ISSR標記和1個性別分化標記。同時采用分池法，分離出兩個和抗楊盤二孢菌緊密連鎖的RAPD分子標記。張燕梅[25-26]將與美洲黑楊抗黑斑病基因連鎖的RAPD標記OPAI17-1550、OPAI13-900轉化成顯性SCAR(序列特異性擴增區域)標記(SAI17-1)和共顯性SCAR標記(SAI13-2)。

在美洲黑楊×歐美楊F1代遺傳圖譜中，共檢測到3個達到顯著水平的楊樹黑斑病QTL位點，MBD1、MBD2、MBD3，分別位于楊樹同源連鎖群Ⅱ、Ⅳ和ⅩⅨ。其中位于連鎖群Ⅳ和ⅩⅨ的位點分別與毛果楊×美洲黑楊定位的楊樹抗銹病基因位點位于同源連鎖群上，說明楊樹抗黑斑病機理于抗銹病的抗病機理可能存在相似之處。在3個位點所在的基因組區域都篩選到了與抗黑斑病相關的候選基因，且候選基因存在聚集分布現象。利用實時定量RT-PCR分析QTLs目標區段候選基因在黑斑病病原誘導下的表達情況，一個AP2類型轉錄因子在抗病植株中表達上調，而感病植物中沒有明顯變化[17]。

曾燕如[4]利用熒光差異顯示反轉錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，從楊樹黑斑病的感抗無性系中分離出12個與抗病相關的cDNA片段，這些片段與病原菌識別、超敏反應體系表達基因、系統獲得抗性和細胞保護機制等有關，并在此基礎上構建了感抗無性系的cDNA文庫，為楊樹黑斑病抗病機理的研究奠定了一定的基礎。張新葉[27]利用EST技術從構建好的2個楊樹感抗黑斑病葉片cDNA文庫中隨機挑取克隆進行測序，獲得21 657條EST序列，其中UniGene10 816個，含量較高的、有功能的基因主要是楊樹葉片組織特異性相關基因和楊樹葉片受外界脅迫表達的抗逆相關基因。對8 853個被注釋的基因中，擔負生物生理過程功能的基因最多，達5 350個。同時根據功能注釋結果挑選3 000個與抗病及其他功能相關的克隆制備了cDNA芯片。

張燕梅[18]利用基因芯片技術從轉錄組水平研究楊樹在受楊生褐盤二孢菌處理后基因表達變化情況，在病原菌處理過程中1 160個基因被不同程度的誘導，這些基因分屬于11個功能類別，其中42%集中在參與新陳代謝、防御反應、信號傳導及轉錄調控的基因。同時1 160個差異表達基因中80%被定位在19條連鎖群上，基因在染色體上末端區域大量聚集，中間區段較少且排列稀疏，此種分布情況是否與植物抗病有關系有待于進一步的研究。

楊樹在受楊盤二孢菌侵染早期，楊樹葉片中抗壞血酸過氧化物酶(APX)和S- 腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)在mRNA水平上均差異表達并且表達量降低，說明兩個酶在與楊樹抗病過程是密切相關的，可能在楊樹防御應答中發揮重要作用[28]。蛋白質水平上，楊生褐盤二孢菌侵染后楊樹有40個差異表達的蛋白點，包括與光合成、蛋白合成、能量代謝、防御應答相關蛋白等，這些蛋白多數在病原脅迫下表達下調[29]。曹友志[7]利用蛋白質雙向電泳技術從培養基中分離楊生褐盤二孢菌分泌蛋白，并利用MS-BLAST鑒定出其中的四個蛋白，有三個是細胞膜降解酶，一個是病原激發子蛋白。

效應因子具有干擾植物病原相關分子模式誘發性免疫及相關級聯反應的功能，是研究植物與病原菌間相互作用的重要部分[24]。曹友志[24]等根據楊生褐盤二孢菌測序信息和植物病原菌效應因子的特點，預測出106個候選效應因子，并成功克隆25個。利用楊樹原生質體瞬時表達系統鑒定出4個效應因子蛋白可以抑制楊樹轉錄因子WRKY29啟動子的活性，可能會影響到病原微生物侵染信號在植物細胞內的傳導，進而干擾植物免疫系統。

另外以前被人們忽視的小分子物質在生命活動中發揮了重要的作用，楊生褐盤二孢菌在侵染南林895楊后，miRNA156a和miRNA164a的表達水平均受到明顯抑制，可能參與了南林895楊抵抗病原菌侵染的過程[30]。

5 其他方面

除了病原菌分類、寄主抗病性、抗病機制以及分子生物學方面的研究之外，我國的研究學者對楊樹黑斑病的預測預報、空間分布型、綜合防治等方面也有研究。

楊樹黑斑病的流行受溫度、降雨量和相對濕度等氣候條件的影響，各地區因氣候條件差異病害流行規律也不盡相同。東北地區楊樹黑斑病一般7月上旬開始發生，7月下旬至8月上旬為發病高峰[31]。北京地區白楊派黑斑病5月初即可發生，7—8月達到高峰，黑楊派、青楊派及其派間、派內的雜交種7月中旬開始發生，8月上旬為高峰期，9月末基本停止[32]。而南京地區毛白楊、響葉楊黑斑病4月初開始發病，5月發病最重，7—9月基本停止發展[33]。

薛煜建立了中國東北地區楊樹黑斑病的短期預報模型及生長損失率的估測模型，對東北地區黑斑病的防治起到了一定的作用[34]。吳佳徽[1]等運用數量化理論Ⅰ建立了北京郊區楊樹黑斑病數量化預測模型,對測報模型檢驗的預測精度在88.49%～96.43%之間，發現楊樹黑斑病菌孢子的飛散量受溫度、濕度和降雨量影響與氣象因子的關系呈多峰曲線。祝繼強等[35]通過計算聚集性指數和聚集性指標分析得出楊樹黑斑病病斑的空間分布型表現為楊樹樹冠葉片上成聚集分布，楊樹黑斑病空間分布型為聚集分布，但接近隨機分布。

對黑斑病的防治，人工掃盡樹下落葉并集中燒毀是減輕病原的主要措施。適地適樹，營造混交林，合理密植，改善通風透光條件等營林措施是預防病害發生的必要措施[3]。藥劑防治在發病初期和發病盛期用煙霧機交替施用2.5%氟硅唑和8%百菌清熱霧劑4次，相隔10 d，防治效果為65.79%，推遲病樹落葉20 d左右[2-3]。

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1005-5215(2017)06-0078-04

2017-03-16

范學恒(1969-)，男，大學，高級工程師，現主要從事森林經營和培育研究.

S435.121

A

10.13601/j.issn.1005-5215.2017.06.029