受體CX3CR1基因敲除對同種異系小鼠氣管移植術后排斥反應的影響

關向前，劉毛妮

(1安徽省立醫院，合肥 230001；2安徽中醫藥大學第一附屬醫院)

受體CX3CR1基因敲除對同種異系小鼠氣管移植術后排斥反應的影響

關向前1，劉毛妮2

(1安徽省立醫院，合肥 230001；2安徽中醫藥大學第一附屬醫院)

目的探討趨化因子受體CX3CR1基因敲除對同種異系小鼠氣管移植后排斥反應的影響。方法將24只小鼠分為同系移植對照組、異系移植對照組、基因敲除移植組，每組各4對。基因敲除移植組、同系移植對照組受體和供體均為BABL/c小鼠；異系移植對照組供體為BABL/c小鼠，受體為C57BL/6小鼠；基因敲除移植組供體為BABL/c小鼠，受體為CX3CR1基因敲除小鼠。各組均行頸背部氣管移植，每只受鼠移植2段氣管。4周后取出各受鼠移植氣管段，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察管腔纖維化阻塞情況；采用ELISA法檢測受鼠血清高遷移率族蛋白1(HMGB1)水平。結果同系移植對照組8個移植氣管段均無管腔阻塞，阻塞分數為0；異系移植對照8個移植氣管段均出現管腔阻塞，移植氣管管腔內充滿黏液，鏡下見管腔內有大量增生的成纖維細胞，阻塞分數為8.0；受體敲除移植組8個移植氣管段中1個出現管腔受擠壓、扭曲，1個阻塞不明顯，其余6個均未出現較明顯的管腔纖維化阻塞，移植氣管管腔內充滿黏液，鏡下見管腔內有大量增生的成纖維細胞，阻塞分數為0.96。移植后4周同系移植對照組、異系移植對照組、基因敲除移植組血清HMGB1水平分別為(29.8±1.6)、(83.6±1.4)、(19.8±0.9)ng/mL，基因敲除移植組明顯低于異系移植對照組(P<0.05)，但與同系移植對照組比較，P>0.05。結論受體CX3CR1基因敲除可明顯減輕氣管移植后排斥反應。

CX3CR1；基因敲除；氣管移植；排斥反應；小鼠

肺移植是終末期肺疾病最有效的治療方式，但目前其移植生存率明顯低于其他實質器官移植[1]。肺移植后排斥反應主要是以氣管為靶點的宿主抗移植物免疫排斥反應。氣管排斥反應主要表現為氣道炎癥、氣道重塑以及氣道上皮細胞向間充質細胞的轉化，氣道上皮細胞主要轉化為成纖維細胞；成纖維細胞進一步增殖，并分泌大量彈性纖維，阻塞氣管腔，導致閉塞性細支氣管炎(OB)[2]。OB是影響肺移植受者長期存活的首要因素[3,4]，抑制OB自然成為提高肺移植存活率的有效方法[5～7]。CX3CR1是趨化因子受體，主要在巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞表達。CX3CR1及其配體被證實具有調控炎性細胞向炎癥部位遷移和招募的作用[8]，同時CX3CR1具有調節單核細胞分化、增殖的作用，且在腫瘤轉移及肝臟纖維化形成中有重要的促進作用[9～11]。上述提示CX3CR1可能參與了移植后OB的發生過程。為驗證這一推測，我們觀察了趨化因子受體CX3CR1基因敲除對同種異系小鼠氣管移植后排斥反應的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：24只小鼠均以常規條件飼養于安徽醫科大學動物實驗中心SPF級動物房。純系BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2004-0007。CX3CR1-基因敲除的C57BL/6小鼠由美國Jackon實驗室提供。

1.2 頸背部氣管移植 將24只小鼠分為三組，每組各4對。同系移植對照組受體和供體均為BABL/c小鼠；異系移植對照組供體為BABL/c小鼠，受體為C57BL/6小鼠；基因敲除移植組供體為BABL/c小鼠，受體為CX3CR1基因敲除小鼠。三組均行頸背部氣管移植。手術前將供鼠脫頸處死，放入裝有 75%乙醇的燒杯中 15 min，杯口密封。取出 8 個軟骨環長度的氣管，放入盛有生理鹽水的培養皿中，用 1 mL注射器輕輕沖洗管腔2～3次。受鼠麻醉后，剃去受鼠頸背部毛發，碘酒消毒皮膚，然后在頸背部兩側用消過毒的眼科剪剪出兩個 2～3 mm裂口(將皮剪破即可，不要剪過深)，并沿前爪方向在皮下捅出一條皮下遂道(注意保持皮膚的完整性)。將從供鼠取下的氣管段用消過毒的彎鑷放入皮下遂道底部，縫合裂口(手術過程在超凈臺內進行)。手術后，將受鼠放入清潔級動物房飼養，每 2 天觀察受鼠的精神狀態和手術部位感染及毛發恢復情況，并適當添加繁殖飼料，更換水。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 移植氣管阻塞程度 各組均于移植4周取出各移植氣管，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察氣管腔纖維化閉塞情況，計算各移植氣管阻塞分數。移植氣管段阻塞分數=管腔阻塞面積/管腔總面積，完全阻塞則阻塞分數為1.0，完全不阻塞則阻塞分數為0.0。各組移植氣管阻塞程度為該組各個移植氣管段阻塞分數之和。

1.3.2 血清高遷移率族蛋白1(HMGB1)水平 移植4周抽取各組靜脈血，分離血清，采用ELISA法檢測HMGB1，操作按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 各組移植氣管阻塞情況比較 同系移植對照組8個移植氣管段均無管腔阻塞，阻塞分數為0；異系移植對照組8個移植氣管段均出現管腔阻塞，移植氣管管腔內充滿黏液，鏡下見管腔內有大量增殖的成纖維細胞，阻塞分數為8.0；基因敲除移植組8個移植氣管段中1個出現管腔受擠壓、扭曲，1個阻塞不明顯，其余6個均未出現較明顯的管腔纖維化阻塞，移植氣管管腔內充滿黏液，鏡下見管腔內有大量增生的成纖維細胞，阻塞分數為0.96。

2.2 各組血清HMGB1水平比較 移植后4周基因敲除移植組血清HMGB1水平分別為(29.8±1.6)、(83.6±1.4)、(19.8±0.9)ng/mL。基因敲除移植組血清HMGB1水平低于異系移植對照組(P<0.05)，但與同系移植對照組比較P>0.05。

3 討論

器官移植排斥反應的本質是受體免疫系統針對來自供體的移植物的攻擊反應及免疫應答[12]。氣管移植后發生的OB是免疫和/非免疫因素所造成的細小支氣管炎癥反應性損傷及異常修復過程，多數學者認為免疫排斥反應是其首要原因[1]。氣管移植排斥的主要靶器官是氣道上皮，即受者針對移植物氣管上皮發生相應的應答反應。 OB發生后氣道上皮膠原沉積和廣泛的纖維組織增生，最終阻塞氣管[13～15]。

OB的發展進程從時間上可以分為上皮損傷期、炎癥浸潤期和纖維化增生期[16,17]。炎癥浸潤期屬于過渡階段，是由于上皮損傷激活固有免疫系統，引起巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞向特定部位遷移，并分泌、釋放多種炎性因子，促使上皮細胞間充質轉化的發生，為纖維化阻塞的形成奠定基礎[18～20]。

目前氣管移植動物模型主要分為原位移植和異位移植。本研究我們建立了小鼠頸背部氣管移植模型，屬于異位移植，此模型穩定，操作方便，感染率低。實驗中我們選擇趨化因子受體CX3CR1作為研究靶標，試圖通過在炎癥浸潤期干擾炎性細胞的遷移和浸潤來抑制移植后排斥反應。本研究結果顯示，基因敲除移植組和同系對照組氣管阻塞情況明顯好于異系對照組。基因敲除移植組和同系對照組血清HMGB1水平明顯低于異系對照組。表明受體CX3CR1基因敲除可明顯減輕氣管移植后排斥反應。對此結果，我們初步的解釋是：CX3CR1基因敲除主要影響了炎癥浸潤期巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞的遷移，從而抑制整個OB的發展進程。其具體機制和信號通路尚有待更進一步、更深入的研究。

HMGB1是一種核DNA結合蛋白，被稱為“DNA伴侶”，參與DNA的復制、轉錄及修飾過程。在細胞處于炎癥、感染、損傷情況下，HMGB1即從細胞內主動釋放至細胞外，參與細胞(或機體)應激過程，如免疫應答或移植排斥，故亦被稱為損傷式分子蛋白(DAMP)。據文獻報道，在同種小鼠氣管移植排斥過程中，HMGB1分子亦從氣管上皮細胞內轉移至細胞外，通過RAGE/NF-κB/TGF-β信號途徑參與移植后閉塞性氣管炎的發生發展，其在移植受體血清中的表達水平也是明顯升高的[21]。本研究采用受鼠血清HMGB1水平來間接反應移植排斥情況，結果發現與病理檢測結果一致。但HMGB1與CX3CR1在促進氣管移植排斥過程中的內在聯系在本研究中未得以揭示，尚需要更深入的研究。

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EffectofCX3CR1geneknockoutonrejectionofallogeneicmiceaftertrachealtransplantation

GUANXiangqian1,LIUMaoni

(1AnhuiProvincialHospital,Hefei230001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of chemokine receptor CX3CR1 gene knockout on rejection of allogeneic mice after tracheal transplantation.MethodsTwenty-four mice were divided into three groups: homologous control group, allogenic control group, and gene knockout transplantation group with 4 pairs in each. In the homologous control group, all donor mice and recipient mice were BALB/c mice. In the allogenic control group, donor mice were BALB/c mice, and recipient mice were C57BL/6 male mice. In the gene knockout transplantation group, donor mice were BALB/c mice, and recipient mice were CX3CR1 knockout mice (C57BL/6 background). Trancheal transplantation operation was performed in all groups, and each recipient mouse was transplanted with 2 tracheas. At week 4 after transplantation, the tracheal grafts were removed and the pathological change was detected with HE staining. Meanwhile, the serum high-mobility group box 1 protein (HMGB1) levels in the recipients of each group were detected with ELISA.ResultsHE staining showed that there was no fibrosis in the tracheal grafts from the homologous control group, and the blocking score was 0. All tracheal grafts from the allogenic control group had fibrosis, and the blocking score was 8.0. In the gene knockout transplantation group, 1 tracheal graft had fibrosis, and the blocking score was only 0.96. At week 4 after transplantation, the HMGB1 levels in the homologous control group, allogenic control group, and gene knockout transplantation group were (29.8±1.6), (83.6±1.4), and (19.8±0.9) ng/mL, and the HMGB1 level was lower in the gene knockout transplantation group than in the allogenic control group (P<0.05), but no significantly difference was found between the homologous control group and the gene knockout transplantation group (P>0.05).ConclusionReceptor CX3CR1 knockout can significantly reduce the rejection after tracheal transplantation.

CX3CR1; gene knockout; trachea transplantation; rejection; mice

國家自然科學基金資助項目(30972779)。

關向前(1983-)，男，碩士，主要研究方向：移植免疫學和細胞免疫學。E-mail: gxq466216@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.007

R617

A

1002-266X(2017)40-0026-03

2016-09-04)