斑馬魚胚胎及成年斑馬魚端腦中神經膠質成熟因子β的表達觀察

杜明君，殷果(南方醫科大學南方醫院，廣州 510515)

斑馬魚胚胎及成年斑馬魚端腦中神經膠質成熟因子β的表達觀察

杜明君，殷果
(南方醫科大學南方醫院，廣州 510515)

目的 觀察斑馬魚胚胎及成年斑馬魚端腦中神經膠質成熟因子β(GMFβ)的表達變化。方法 采用整胚原位雜交技術檢測斑馬魚胚胎中的GMFβ mRNA；采用Western blotting法檢測斑馬魚胚胎中的GMFβ蛋白；采用免疫熒光組織染色法檢測成年斑馬魚端腦中的GMFβ蛋白。結果 斑馬魚胚胎中GMFβ mRNA在受精3～12 h呈廣泛性表達；受精24 h主要表達于眼原基、端腦、間腦、中腦、后腦和脊髓；受精48 h以后主要表達于腦部和視網膜；受精72 h表達強度最高，之后逐漸減弱，受精7 d呈微弱表達。斑馬魚胚胎中GMFβ蛋白在受精3 h開始表達，之后逐漸升高，受精72 h表達強度最高。成年斑馬魚端腦中GMFβ主要表達于背側端腦和腹側端腦的背側核，而腹側端腦的腹側核和皮質下區域均未見GMFβ表達。結論 斑馬魚胚胎發育時期GMFβ逐漸集中于腦部，成年后GMFβ陽性細胞主要在端腦的增殖活躍區(中縫和背側端腦)。

神經膠質成熟因子β；斑馬魚；神經發育；整體原位雜交；蛋白印跡法；免疫熒光組織染色

神經膠質成熟因子(GMF)基因家族在脊椎動物中包括神經膠質成熟因子β(GMFβ)和神經膠質成熟因子γ(GMFγ)兩個亞型，它們都是ADF/cofilin超家族蛋白新成員，參與肌動蛋白骨架改裝[1～3]。GMFβ是一種相對分子質量為17 kD的高度保守蛋白，它包含約142個氨基酸殘基，主要在脊椎動物的大腦表達，部分見于胸腺和小腸[4, 5]。在大腦中GMFβ主要在星形膠質細胞表達，具有營養神經和神經保護作用[6]。近年來大量研究發現GMFβ在星形膠質細胞中通過p38 絲裂原活化蛋白激酶和轉錄因子NF-κB 調節胞內壓力相關信號通路[7, 8]，在神經退行性疾病的腦組織和膠質瘤、卵巢癌組織中表達升高[9～11]，提示GMFβ在脊椎動物中起著復雜的作用。然而，關于GMFβ是否參與神經發育、神經元分化成熟的調控，以及如何調節神經發育和分化的報道卻十分少見。因此，研究GMFβ在胚胎的發育過程以及在成年個體中的組織分布，對研究GMFβ在神經發育和神經元分化中發揮的作用具有重要的指導作用。本研究觀察了斑馬魚胚胎及成年斑馬魚端腦中GMFβ的表達。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚胚胎、成年斑馬魚端腦標本的制備 性成熟AB野生型斑馬魚由南方醫院臨床醫學實驗研究中心斑馬魚養殖室繁殖培養。提前1 d將AB野生型斑馬魚按照雌雄1∶1的比例放入孵化盒中，用隔板將雌雄分開。第二天早晨抽去隔板,雄魚開始追逐雌魚,一般15 min左右開始排卵 ,用一個小篩網收取受精卵,流水稍微沖洗后，裝到含有美蘭的系統水的潔凈培養皿中,每皿約50個,放到28.5 ℃培箱中。分別收集受精3、6、9、12、24、48、72 h的斑馬魚胚胎和7 d的斑馬魚幼魚。受精24 h后的胚胎給予0.003%苯硫脲(PTU)處理阻止黑色素形成。收集的胚胎經固定、梯度甲醛脫水后保存于-20 ℃備用。取3～6個月斑馬魚端腦于4%多聚甲醛內固定過夜，第2天取出端腦用PBS洗5 min，放于包埋盒內。梯度乙醇脫水，二甲苯固定，石蠟包埋，蠟塊于-20 ℃保存備用。

1.2 斑馬魚胚胎中GMFβ mRNA的檢測 采用胚胎原位雜交技術。取備用的各時點斑馬魚胚胎各20枚，室溫下用1× PBST洗去多余甲醇溶液，將胚胎移入68 ℃ 雜交爐中預雜交1 h，然后加入GMFβ基因反義mRNA 探針68 ℃ 雜交過夜。第2天洗去多余的探針后，加入anti-GIG-AP與GMFβ 基因反義mRNA 探針結合過夜。第3天用1×PBST洗去未結合的抗體，再加入BCIP/NBT 溶液顯色，顯微鏡下觀察并記錄結果后，用70%甘油對雜交胚胎進行再固定并且照相。

1.3 斑馬魚胚胎GMFβ蛋白的檢測 采用Western blotting法。取備用的各時點斑馬魚胚胎15～20顆，加入組織蛋白提取液后至勻漿機粉碎勻漿，勻漿后冰浴靜置10 min，然后4 ℃離心15 min，取上清液為蛋白提取液。分光光度計測定蛋白量，取30 μg 蛋白提取液，按照體積1∶4加入上樣緩沖液，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后把分離后的蛋白質轉移到PVDF膜上，5%BSA(牛血清蛋白)室溫封閉1 h。與兔抗GMFβ抗體(1∶1 000)4 ℃過夜孵育。TBST洗滌后，加入抗兔IgG二抗(1∶7 500)室溫孵育1 h。TBST洗滌5 min，重復3次后加入HRP發光液顯色,用化學發光成像系統(Image Station in-Vivo F KODAK)拍照。

1.4 成年斑馬魚端腦GMFβ蛋白的檢測 取備用的成年斑馬魚端腦標本，脫蠟，微波爐抗原修復20 min。在標本上滴加山羊血清，室溫封閉1 h，加入GMFβ兔多克隆抗體(1∶100)4 ℃過夜，次日加入PBST洗3次，每次10 min，加入ALEXA FLUOR 488 山羊抗兔熒光二抗(1∶200)室溫放置1 h，加入PBST洗3次，每次10 min，加入DAPI染色液染色15 min，加入PBST洗3次，每次10 min，滴加抗熒光衰減封片劑封片并用共聚焦拍照儀器拍照。

2 結果

2.1 斑馬魚胚胎中GMFβ mRNA和蛋白的表達情況 斑馬魚胚胎中GMFβ mRNA在受精3～12 h呈廣泛性表達；受精24 h主要表達于眼原基、端腦、間腦、中腦、后腦和脊髓；受精48 h以后主要表達于腦部和視網膜；受精72 h表達強度最高，之后逐漸減弱，受精7 d呈微弱表達。斑馬魚胚胎中GMFβ蛋白在受精3 h開始表達，之后逐漸升高，受精72 h表達強度最高。

2.2 成年斑馬魚端腦中GMFβ蛋白的表達情況 成年斑馬魚端腦中GMFβ表達于細胞內，且主要集中在斑馬魚背側端腦(D)和腹側端腦的背側核(Vd)，而腹側端腦的腹側核(Vv)和皮質下區均未發現GMFβ陽性細胞。

3 討論

斑馬魚作為一種新興的動物模型是研究基因功能的有效載體。斑馬魚的分子途徑調控高度保守，同時具有體外受精、生殖周期短、生殖能力強、高產卵量、體積小、發育快且胚胎透明等優點，可以高效、連續和動態觀察并記錄胚胎的發育[12]。通過原位雜交技術和免疫熒光技術我們發現GMFβ在主要在斑馬魚腦部表達，這與哺乳類動物相似。原位雜交結果顯示，GMFβ mRNA在受精3～12 h呈廣泛性表達；受精24 h主要表達于眼原基、端腦、間腦、中腦、后腦和脊髓；受精48 h之后主要表達于腦部和視網膜，且受精72 h表達最強，之后逐漸減弱，至受精7 d呈微弱表達。這表明在斑馬魚胚胎器官發育形成的過程中，GMFβ一直是高表達的，而在器官發育成型穩定后僅維持微弱的表達。

GMFβ是一個高度保守的蛋白質，最初認為它可以促進脊柱動物的神經元和膠質細胞的生長和分化[13]，通過調節腦源性神經營養因子(BDNF)和神經生長因子(NGF)起到神經營養和神經保護的作用[14]。在大鼠上敲除GMFβ后，出現運動性表現和運動性學習能力受損。作為促炎癥介質，GMFβ通過調節氧化應激，TNF-α、IL-1β等炎癥因子，參與帕金森病和阿爾茲海默病的發生發展[15, 16]。斑馬魚胚胎神經發育的起始時間與原腸胚發育開始的時間同步(約為受精6 h)[17],從受精12 h開始，伴隨胚體生長，背側外胚層內陷形成神經索，發育進入神經胚階段，也稱體節期。到受精16 h(14 體節期)時各主要器官開始發生，神經節分化形成腦的原基。神經系統發育主要從咽裂期(受精24 ～48 h)開始，早期的神經元群體又稱為初級神經元，是相對簡單神經系統的一部分，分化后能夠調節幼魚的不同運動。受精24 h后，這些初級神經元分化建立了許多投射[18]，神經形成和軸突神經通路的發育在受精48 h時達到最大化[19]，GMFβ陽性信號在受精6～48 h均呈高表達，故筆者推測GMFβ在神經系統的形成和分化中發揮重要的作用。目前并沒有相關文獻報道GMFβ在神經系統的形成和分化過程的作用，相應的分子機制亦未明。

免疫熒光顯示GMFβ主要在成年斑馬魚端腦的背側區表達，這是第一次發現并報道的。與哺乳動物不同，成年斑馬魚腦損傷后具有神奇的再生功能,這使得斑馬魚成為研究神經再生很好的模型[20]。斑馬魚腦損傷后的神經再生主要由放射狀膠質細胞增殖、分化轉化成新生神經元并遷移到損傷區域至完全修復。持續的新生神經元生成依賴于足量的放射狀膠質細胞數量[21]。在哺乳動物胚胎神經發育過程中放射狀膠質細胞具有神經干細胞的功能，但是成年后僅極少量的放射狀膠質細胞保留，而成年的斑馬魚端腦中保留了放射狀膠質細胞[22, 23]。成年斑馬魚端腦的背側區是放射狀膠質細胞聚集的區域，亦是增殖活躍的區域[24, 25]。本研究結果顯示GMFβ陽性細胞主要集中在放射狀膠質細胞聚集區域，故筆者猜測GMFβ在放射狀膠質細胞中表達，并參與放射狀膠質細胞的增殖轉化；GMFβ可能參與神經元分化成熟的過程。

中樞神經系統嚴重的機械性、炎癥性、低溫損傷等都會有致殘的可能，目前并無有效的治療方法，其緣由皆因哺乳類動物的神經組織損傷后不能再生，只能瘢痕修復所致。神經再生一直是醫學領域研究的熱點。本研究觀察報道了GMFβ在斑馬魚胚胎到成年的表達定位，推測其可能參與神經再生，對研究GMFβ的功能具有指導作用。在后續實驗中我們將進一步探討GMFβ的作用機理，為治療神經組織損傷提供潛在的靶點。

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吳炳義(E-mail：wubingyi66@126.com)

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2016-10-22)