血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對表達量對帕金森病的診斷效能

韓凱 (焦作市人民醫院，河南焦作454000)

血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對表達量對帕金森病的診斷效能

韓凱
(焦作市人民醫院，河南焦作454000)

目的 評價血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對表達量在帕金森病中的診斷效能。方法 采用RT-PCR法檢測90例帕金森病患者(觀察組)及24例健康人(對照組)外周血清中miR-103a、miR-30b、miR-29a。采用受試者工作曲線法觀察血清miR-103a、miR-30b、miR-29a用于診斷帕金森病的效能。結果 觀察組外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對表達量分別為1.12±0.10、1.57±0.37、1.23±0.09，對照組分別為0.43±0.03、 0.97±0.07、0.51±0.04，觀察組外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對表達量均高于對照組，P均<0.05。外周血清miR-103a診斷帕金森病的AUC為0.816，選擇0.715為診斷閾值時約登指數最大，此時外周血清miR-103a診斷帕金森病的靈敏度為71.3%，特異度為83.9%。外周血清miR-30b診斷帕金森病的AUC為0.789，選擇1.120為診斷閾值時約登指數最大，此時外周血清miR-30b診斷帕金森病的靈敏度為70.5%，特異度為84.6%。外周血清miR-29a診斷帕金森病的AUC為0.756，選擇1.001為診斷閾值時約登指數最大，此時外周血清miR-29a診斷帕金森病的靈敏度為72.1%，特異度為80.8%。結論 帕金森病患者外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對表達量升高。外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對表達量在帕金森疾病中的診斷效能好。

帕金森病；微小RNA;miR-103a；miR-30b；miR-29a

帕金森病是慢性神經退行性疾病，臨床上以運動遲緩、肌強直、靜止性震顫和姿勢步態異常為特征[1, 2]，好發于中老年人群，其發病原因和機制至今尚未完全明確[3, 4]，病情進展嚴重影響患者生活質量[5]。基因突變是導致帕金森病進展的重要影響因素[6～11]。外周血中miRNA由組織細胞釋放入血。已有文獻報道部分miRNA(miR-133b、miR-7、miR-153及miR-433)可作為生物標記物可以用于帕金森病診斷及進展預警。已有文獻報道，胰腺癌患者外周血清miR-103a水平升高，外周血清miR-30b、miR-29a與腎癌、結直腸癌的發生發展有關。相對表達量但是尚未見有關外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對表達量在帕金森病中診斷效能的研究。本研究檢測了帕金森病患者外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對表達量變化，并探討外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對表達量在帕金森病中的診斷效能。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇納入2013年10月～2016年10月收治的90例原發性帕金森病患者，為觀察組。患者均符合歐洲神經病協會聯盟(EFNS)和國際運動障礙性疾病協會歐洲分會《MDS-ES》制定的《帕金森診斷指南》(2013年)中原發性帕金森病診斷標準[12]，其中男44例，女46例，年齡(64.2±10.5)歲，UPDRS分級Ⅰ～Ⅲ級。首診未用藥42例，已經應用左旋多巴治療1年以上48例。另選24例健康人為對照組，其中男10例，女14例，年齡(60.9±11.7)歲。兩組年齡、性別分布差異無統計學意義。本研究已經我院倫理委員會批準。所有入組者均簽署知情同意書。

1.2 外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對表達量檢測方法 采集兩組受檢者外周靜脈血2 mL，加入不含EDTA的普通試管中，在水浴箱(37 ℃)中靜置10 min，至血液完全凝固。室溫條件下，1 500 g離心5 min，充分去除血細胞后吸取上清液置于1.5 mL離心管內并在4 ℃環境下12 000 g離心5 min進一步去除殘余血細胞，吸取上清液置于新的離心管中，統一保存于-80 ℃恒溫冰箱待檢。采用RT-PCR法檢測兩組血清miR-103a、, miR-30b、miR-29a相對表達量。取上述待檢血清樣本(400 μL/份)，遵循mirVanaTMPARISTM試劑盒(美國Applied Biosystem公司產品)說明書中所述步驟提取總RNA。取1 μL RNA在NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer儀(美國NanoDrop公司產品)上測定RNA濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。根據試劑盒步驟從RNA中分離出miRNA。建立10 μL 逆轉錄反應體系：Buffer 2 μL+Primer 1μL+Arrayseript Enzme Mix 0.4 μL+25ng RNA+無RNA酶水至總體積10 μL。逆轉錄反應條件：16 ℃ 30 min，42℃ 30 min，85 ℃ 5 min，反應結束后冰浴冷卻，-80 ℃保存。PCR反應以U6為內參基因，建立20 μL反應體系，反應條件：95 ℃ 10 min，40個PCR循環(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s)。采用2-△△Ct表示miR-103a、miR-30b、miR-29a相對表達量。

1.4 外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對表達量在帕金森病中的診斷效能判斷 將觀察組和對照組合為一組，繪制外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a診斷帕金森病診斷帕金森病的受試者工作曲線(ROC)，計算曲線下面積(AUC)。采用最大約登指數法計算外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a診斷帕金森病的閾值。

2 結果

2.1 兩組外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對表達量比較 觀察組外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對表達量分別為1.12±0.10、1.57±0.37、1.23±0.09，對照組分別為0.43±0.03、 0.97±0.07、0.51±0.04，觀察組外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對表達量均高于對照組，P均<0.05。

2.2 外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對表達量在帕金森病中的診斷效能 外周血清miR-103a診斷帕金森病的AUC為0.816，選擇0.715為診斷閾值時約登指數最大，此時外周血清miR-103a診斷帕金森病的靈敏度為71.3%，特異度為83.9%。外周血清miR-30b診斷帕金森病的AUC為0.789，選擇1.120為診斷閾值時約登指數最大，此時外周血清miR-30b診斷帕金森病的靈敏度為70.5%，特異度為84.6%。外周血清miR-29a診斷帕金森病的AUC為0.756，選擇1.001為診斷閾值時約登指數最大，此時外周血清miR-29a診斷帕金森病的靈敏度為72.1%，特異度為80.8%。

3 討論

帕金森病為臨床一種極為常見的神經退行性病變且與年齡密切相關，主要特征為黑質紋狀體通路存在異常蛋白存儲及特發性神經元丟失，進而導致患者出現認知和運動等多種功能障礙[13]。帕金森病的病理基礎主要為中腦黑質多巴胺能神經元(DNs)選擇性喪失、殘存神經元中路易小體(LB)形成及紋狀體多巴胺含量異常減少[14]，進而導致患者出現靜止性震顫、運動遲緩、肌強直及姿態步態異常等常見的臨床癥狀。既往眾多研究均證實蛋白質表達、轉錄及轉錄后調控在帕金森發病和進展中發揮著極其重要的作用。miRNA為人類19～23號染色體的非編碼RNA，其和目標mRNA分子3'端非編碼區域(3'UTR)序列互補結合，降解靶mRNA或者抑制靶mRNA翻譯，介導轉錄后可致基因沉默，和神經系統疾病、腫瘤等疾病發生發展密切相關[15]，目前miRNA表達譜相比于腫瘤疾病而言神經退行性疾病研究較少，隨著對帕金森疾病相關基因miRNA及其潛在的作用靶位點的深入研究，可為分析帕金森病相關基因分子機制及調控網絡提供新的線索，進一步明確miRNA在帕金森病等神經退行性疾病發生發展中的作用和機制。既往研究證明了miR-133b、miR-7、miR-153以及miR-433在帕金森病中發揮發展中的作用[16]。本研究觀察了外周血清miR-103a、miR-30b和miR-29a相對表達量在帕金森病中的診斷效能，結果顯示，帕金森患者組外周血清miR-103a、miR-30b和miR-29a表達均較對照組升高，且外周血清miR-103a、miR-30b和miR-29a在帕金森病中的診斷效能較好，AUC均在0.7以上。外周血清miR-103a、miR-30b和miR-29a相對表達量是可以用于帕金森病診斷的新血清標志物。

本研究局限性在于本研究為單中心、橫斷面、非隨機研究，樣本例數少。故本研究結果需大規模多中心的前瞻、隨機、雙盲對照研究進行驗證。

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