C18柱串聯冠醚手性柱高效分離3種芳香族氨基酸對映體

劉育堅　劉智敏　許志剛

摘要將C18柱與手性冠醚柱串聯，建立了一種反相高效液相色譜法用于3種芳香族氨基酸對映體同時拆分的方法。考察了反相色譜流動相的組成、pH值、柱溫、流速對對映體拆分的影響。實驗結果表明， 當流動相為HClO4乙腈溶液（86∶14， V/V， pH 2.0）、柱溫20℃、流速0.4 mL/min時，3種氨基酸對映體可獲得基線分離。進一步對比了C18柱、冠醚手性柱和串聯順序不同的4種分離模式，結果表明，C18柱不能拆分氨基酸對映體，僅能分離不同種類氨基酸； 冠醚手性柱可分離氨基酸映體，但不同種類氨基酸色譜峰出現重疊； 串聯模式能實現3種氨基酸對映體的基線分離，實現雙柱優勢互補，而串聯順序對分離影響不大，僅影響色譜峰的峰形。

關鍵詞手性分離； 芳香族氨基酸； 對映體； 冠醚柱

1引言

手性是自然界的基本屬性，手性分子對映異構體因其結構的差異而具有不同的光學性能和生物活性[1～3]。氨基酸是蛋白質最基本的組成單元，大多數的氨基酸都存在手性中心，故在臨床診斷和食品分析等領域均涉及氨基酸的手性分離與分析[4，5]。常見的α氨基酸大多是L構型，是人體重要的營養物質； 而如阿爾茨海默癥等某些重要的生理疾病則與D構型的氨基酸的濃度變化息息相關[6]。芳香族氨基酸是指含有芳香環的氨基酸，包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等[7]。在蛋白質化學和臨床診斷與研究中，對芳香族氨基酸定量分析有著重要意義[8]。

手性化合物的拆分通常以正相色譜居多，可以獲得較好的分離效果。然而，反相手性色譜具有毒性小、成本低的優點，并與實際樣品具有更好的相容性。近年來，反相手性色譜固定相和反相手性色譜拆分都得到了快速發展[9]，出現了一些適用于含水樣品中外消旋體分離的反相色譜分析方法[10～12]。然而，單一色譜柱常不能有效解決復雜樣品的手性分離分析問題， 色譜柱串聯技術的提出，使這一問題得到一定程度的解決[13]。

C18柱與手性柱進行串聯，可同時發揮兩類色譜柱的作用，有助于進一步提升色譜分離效能。目前，已有C18柱串聯手性柱拆分外消旋體的報道。Sardella[14]等利用C18柱與奎寧手性柱串聯，同時拆分了甲狀腺素和三碘甲狀腺氨酸對映體。Perera等[15]將C18柱分別與3種手性柱串聯，對16種手性藥物進行了拆分，手性化合物之間得到了較好分離，結果也表明手性柱和流動相的選擇是影響串聯分離的重要因素。目前還未見此串聯技術用于手性氨基酸的分離。氨基酸的分離常需使用專用的氨基酸柱，對色譜分離條件有特定的要求，有時還需要柱前衍生[16]或使用手性添加劑[17]。本研究以3種芳香族氨基酸（結構如圖1所示）外消旋體為拆分對象，建立了C18柱串聯手性冠醚柱同時拆分多種氨基酸對映體的反相色譜方法，實現了多種氨基酸對映體的高效分離，也為多種手性化合物的同時分離提供了新思路。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀（美國戴安公司），配備DAD檢測器、自動進樣器； Innoval ASB C18色譜柱（50 mm × 4.6 mm， 5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）； CROWNPAK CRI（+）（150 mm × 3.0 mm， 5 μm，大賽璐藥物手性技術上海有限公司）； PS20潔康超聲波清洗機（東莞潔康超聲波設備有限公司）。

苯丙氨酸（99%）、乙腈（北京百靈威科技有限公司）； 色氨酸（99%，阿拉丁試劑上海有限公司）； 酪氨酸（98%，薩恩化學技術上海有限公司）； HClO4（分析純，天津市鑫源化工有限公司）； 實驗用水為純凈水。

2.2實驗方法

準確稱取適量的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸外消旋體標準品，以流動相為溶劑，配制成50 mg/L的3種氨基酸混合標準溶液。將C18柱與CRI（+）柱串聯，C18柱在前、手性冠醚柱在后，通過高效液相色譜進行手性拆分。流動相為HClO4乙腈溶液（pH 2.0），檢測波長為200 nm，進樣量為20 μL，拆分中分別對流動相的配比、pH值、流速和柱溫進行優化，其中t1和t2分別為氨基酸兩個對映體的保留時間， Rs為分離度。

3結果與討論

3.1流動相比例對拆分的影響

流動相的種類對手性分離的影響最為重要。冠醚柱CROWNPAK CRI（+）在HClO4溶液和乙腈組成的流動相中對手性氨基酸具有較好的分離效果，并結合文獻所采用的流動相[18，19]，以HClO4乙腈溶液（pH 1.5）為基礎，通過改變流動相的比例，研究3種氨基酸混合物在串聯柱上的手性分離效果，C18柱在前，手性冠醚柱CRI（+）在后，結果如表1所示。在所選條件下，3種氨基酸對映體均得到基線分離，酪氨酸最先被洗脫出來，色氨酸則保留時間最長； 隨著流動相中乙腈比例的增多，對映體在兩根色譜柱上的保留時間減少，分離度降低。兼顧3種氨基酸同時分離的分離度和分析效率，選擇HClO4乙腈溶液（86∶14， V/V， pH 2.0）。

3.2HClO4溶液pH值對拆分的影響

流動相中pH值會影響分析物的存在形態，進而影響對映體在串聯柱上的保留行為。分別調節HClO4溶液的pH值為1.5、2.0、2.5，HClO4溶液與乙腈的體積比為86∶14， 3種氨基酸對映體在3種不同pH值下的分離結果如圖2所示。在使用pH 1.5和2.0的HClO4溶液為流動相時，所有的氨基酸對映體得到基線分離； 而HClO4溶液的pH 2.5時，3種氨基酸對映體出峰時間早且分離效果差，酪氨酸和苯丙氨酸兩對對映體的4個色譜峰重疊在一起，在C18柱和手性柱上均沒有被分離。結果表明：降低pH值可以得到更大程度的分離，氨基酸上的氨基在HClO4溶液中會被質子化，同時氨基酸的NH+4在手性聯萘冠醚空腔內的作用增強，使得分析物在色譜柱上的保留時間增加。 進一步降低pH值時，各色譜峰的分離度增大，但出峰時間太長，綜合考慮，選擇流動相pH=2.0進行分離。