一例豬肺炎鏈球菌病的診斷與防治

劉 杰，劉維康

(河南省洛陽市普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000）

一例豬肺炎鏈球菌病的診斷與防治

劉 杰，劉維康

(河南省洛陽市普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000）

肺炎鏈球菌又稱肺炎球菌為鏈球菌屬一員，主要寄生在人和動物的呼吸道中，豬肺炎鏈球菌病的主要癥狀為幼畜出現敗血癥和大葉性肺炎及腦膜炎等；在臨床診斷中發現疑似病例，并在實驗室診斷中分離到一株疑似菌株，經形態學、生化及分子鑒定確定為肺炎鏈球菌；藥敏試驗結果為病原菌對頭孢噻呋、左氧氟沙星、桿菌肽、阿米卡星高度敏感，對甲氧芐啶、卡那霉素、甲砜霉素、鹽酸克林霉素、鹽酸林可霉素、慶大霉素不敏感。

豬肺炎鏈球菌；生化鑒定；PCR鑒定；藥敏試驗

2016年11月河南某豬場剛斷奶仔豬發生以咳嗽、呼吸困難、發熱為主要特征的傳染病。通過對病豬進行解剖發現病死豬氣管內充滿泡沫狀分泌物，肺呈大葉性肺炎變化，有不同程度病變，經實驗室診斷確定為豬肺炎鏈球菌。

1 材料與方法

1.1 組織

無菌采集發病仔豬的肺臟。

1.2 主要培養基及試劑

哥倫比亞血瓊脂基礎培養基、胰蛋白胨大豆肉湯培養基和MH培養基，由青島海博試劑有限公司提供；革蘭氏染色試劑購自北京索萊寶科技有限公司；DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker等購自寶生物（大連）工程有限公司；細菌微量生化管及藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

圖1 肺炎球菌菌落形態

表1 生化鑒定結果

圖2 分子鑒定結果

表2 藥敏試驗結果

1.3 方法

1.3.1 培養基制備

按照配方稱取足量哥倫比亞血瓊脂基礎培養基，加相應的純化水配制100 mL培養基，121 ℃，滅菌15 min，滅菌結束后待培養基溫度降至50 ℃左右，加入5 mL的綿羊血，搖勻，制成血平皿。

1.3.2 細菌分離

無菌取肺臟病變組織觸片染色鏡檢，并接種于血培養基上， 37 ℃，培養24 h，觀察菌落形態，挑取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

1.3.3 生化鑒定

挑取疑似單個菌落接種于微量生化管，進行相應的生化鑒定。

1.3.4 分子鑒定

針對鏈球菌延伸因子EF-Tu基因，杜海燕等[1]設計了一對引物，序列為：P1：5’-GTACAGTTGCTTCAGGACGTATC-3’/ P2：5’-ACGTTCGATTTCATCACGTT-3’擴增的目的片段大小為197 bp，有寶生物工程（大連）有限公司合成。

采用25μL反應體系，即10×PCR Buffer2.5μL、dNTP 2.0μL、DNA Taq酶0.5μL，P1/P2引物各1.0μL，DNA模板2.0μL，ddH2O 16.0μL。PCR反應條件為：95 ℃5 min，95 ℃1 min，59 ℃1 min，72 ℃1 min，共30個循環；72 ℃5 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.5 藥敏試驗

挑取疑似單個菌落接種于10 mLTSB血清培養基，置于37 ℃恒溫搖床中，培養5～6 h，取100μL均勻涂布于MH培養基上。用紙片瓊脂擴散法（K-B法）[2]，按使用說明書將藥敏片均勻放置在其上，37 ℃培養16～18 h后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，根據說明書敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株的藥敏性。

2 結果

2.1 細菌分離結果

取肺臟病變組織進行觸片革蘭氏染色鏡檢，可見有橢圓形單個細菌存在。菌落在血平皿上呈β溶血，革蘭氏染色為陽性球菌，菌落表面凹陷呈臍狀，如圖1。

2.2 生化鑒定結果

生化鑒定結果如表1。

2.3 分子鑒定結果

取單個純化且具有典型特點的菌落進行PCR鑒定，并設陽性和陰性對照，根據結果可判定為鏈球菌，結果如圖2。

2.4 藥敏試驗結果

根據以上結果，選取藥物進行藥敏試驗，結果如表2。

3 討論

肺炎鏈球菌又稱肺炎球菌為鏈球菌屬一員，在自然界中分布非常廣泛[3]，主要寄生在人和動物的呼吸道中，當某些原因使機體抵抗力下降時，可引起人和動物的內源性感染，也可發生外源性感染，主要引起幼畜敗血癥和大葉性肺炎及腦膜炎等。

豬肺炎鏈球菌病的臨床癥狀與常見的呼吸道疾病相似[4]，較難進行區分，且病原差異較大，用藥方向有別。豬場發病后，一般常診斷為豬藍耳病、豬傳染性接觸性胸膜肺炎或豬肺疫等，易出現誤診，造成重大損失。

引發豬肺炎鏈球菌病主要與飼養管理水平密切相關，由于管理不科學，造成豬本身抵抗力不強，主要誘因是通風不良、氨氣濃度過高等，另外本病還會引起繼發感染，造成較大損失[5]。實際生產過程中應當加強科學管理和飼養，提高機體抵抗力，另外要接受該病原菌在環境中大量存在的現實，定期進行環境衛生消毒。

[1] 杜海燕，李基棕，周碧君，等. 鏈球菌通用PCR檢測方法的建立及應用[J]. 貴州農業科學，2009（12）：152-154.

[2] 譚瑤，趙清，舒為群，等. K-B紙片擴散法藥敏試驗[J].檢驗醫學與臨床，2010（20）：2290-2291.

[3] 曲哲會，郭曉秋. 豬肺炎球菌病的診斷與治療[J].上海畜牧獸醫通訊，2010（4）：119.

[4] 邰振國.豬的肺炎球菌病[J].上海畜牧獸醫通訊，1998（3）：42.

[5] 黃鑒明，向陽，向明，等. 豬肺炎球菌病的診治[J].中國預防獸醫學報，2002，24（1）：65.

2016-12-12）