TGEV和PEDV的多重PCR方法在豬傳染性胃腸炎病毒檢測中的應用研究

黃紅

（黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

摘要：目的：通過應用同時檢測豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的多重RT-PCR 方法，并對其進行特異性與敏感性試驗。方法：對本地區150份臨床疑似病毒性腹瀉病料進行檢測，檢測了仔豬腹瀉的糞便或小腸組織共150份病料。在實驗室檢測中，此方法能檢測約50 TCID50的混合病毒，能夠擴增出3條長度為750 bp（PEDV）、544 bp（TGEV）、275 bp（PARV）特異性片段，而其它病毒無特異性條帶。結果：PEDV、TGEV陽性率分別為54.67%（82/150）、8.0%（12/150）。PEDV 與TGEV 混合感染率為5.33%。結論：同時檢測豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的多重RT-PCR 方法的應用對臨床上進行這兩種疾病混合感染的檢測具有重要意義。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；TGEV；PEDV；PCR檢測

豬是唯一自然感染的動物，任何年齡豬只皆會感染發病，此病是通過糞口途徑傳播，好發于濕冷的天氣，尤其是冬春、秋冬季節交換之際。感染豬臨床上以嘔吐、水樣下痢及脫水為主征，造成出生仔豬高死亡率[1]，死亡率可高達100%。豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）中的冠狀病毒屬（Corona virus），為具封套的正股單鏈RNA 病毒[2]。將其感染PD5 細胞株，以acridine orange 或propidium iodide 染劑將細胞核染色后，于熒光顯微鏡下觀察可見染色質密度增加并有凋亡小體的產生[3]。經電泳分析可見其DNA 階梯狀的現象，另以掃描式電子顯微鏡也可見到細胞表面泡狀化及凋亡小體的產生[4]。豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和目前引起人類非典型肺炎的嚴重急性呼吸道癥候群（Severe acute respiratory syndrome，SARS）同屬冠狀病毒科（Coronaviridae）中的冠狀病毒屬（Coronavirus）。細胞凋亡對多細胞生物個體發育、正常細胞更新、各組織保持正常結構與功能有著積極而重要的意義。[5]而研究細胞凋亡的基因表達與調控及其信息傳遞機制，對基礎細胞生物學、生物醫學及某些疾病的診斷和治療都將產生深遠影響，故有關細胞凋亡測試方法的研究也成為當今國內外研究的新熱點，這也為細胞凋亡分析測試方法的研究提出了一個更加嚴峻的課題，這方面的研究有待繼續深入[6]。

本實驗對本地區150份臨床疑似病毒性腹瀉病料進行檢測，檢測了仔豬腹瀉的糞便或小腸組織共150份病料，現報告如下。

1材料與方法

1.1病毒與病料

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）CV777 毒株、豬傳染性胃腸炎（TGEV）JSXB2010 毒株，均由本實驗室保存。

1.2檢測方法

對本地區150份臨床疑似病毒性腹瀉病料進行檢測，檢測了仔豬腹瀉的糞便或小腸組織共150份病料。在實驗室檢測中，此方法能檢測約50 TCID50的混合病毒，能夠擴增出3條長度為750 bp（PEDV）、544 bp（TGEV）、275 bp（PARV）特異性片段，而其它病毒無特異性條帶。

2結果

2.1多重RT-PCR 的特異性

PEDV、TGEV陽性率分別為54.67%（82/150）、8.0%（12/150）。PEDV 與TGEV 混合感染率為5.33（8/150）。

2.2多重RT-PCR 的敏感性

將兩種病毒混合后提取的RNA 全部反轉錄所得cDNA 按10倍比稀釋，在確定的退火溫度以及引物濃度下，其它條件不變，進行PCR 擴增。假定所提取的RNA 無降解，全部反轉錄，此多重RT-PCR 可檢測到約50 TCID50的混合病毒量。

討論：通過本實驗結果顯示，無論是在形態學上或生化學檢測方面，都符合細胞凋亡的特征，證實豬傳染性胃腸炎病毒于PD5 豬腎細胞株可誘發細胞凋亡的現象，且初步分析病毒感染后細胞的caspase 的活性，可見caspase-2，-3，-4，-6，-8，-9，-10活性皆有增加，顯示本病毒可能通過細胞表面死亡受體的外在路徑或通過粒線體調控的內在路徑引發細胞凋亡[7]。目前已有研究證明多種病毒、細菌都可誘發細胞凋亡的機轉，其中又以病毒最被廣為研究，且亦多種病毒基因被證明與細胞凋亡有直接的關系，未來可通過更深入的研究以了解TGEV 誘發細胞凋亡的信息傳遞路徑及其分子機制，以供其它冠狀病毒細胞凋亡分子模型的參考[8]。方法靈敏度與特異性高，尤其是對早期凋亡細胞的檢測，但仍需配合細胞形態學的特征而加以判斷。另通過掃描式電子顯微鏡的觀察，也可明顯見到細胞表面呈現泡狀化的細胞，及由凋亡細胞脫落出凋亡小體的現象。本組資料顯示，同時檢測豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的多重RT-PCR 方法的應用對臨床上進行這兩種疾病混合感染的檢測具有重要意義。

參考文獻：

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