黑曲霉代謝組學研究進展*

靳夢琦 李 軍 朱鳳妹 劉 暢

1（河北科技師范學院食品科技學院，河北昌黎066600）

2（河北省果品加工工程技術研究中心，河北昌黎066600）

黑曲霉是一種廣泛存在于自然界中的絲狀子囊真菌，屬于真核生物。黑曲霉的分生孢子頭呈黑褐色放射狀，頂囊呈球形，雙層小梗，多見于糧食、植物性產品以及土壤中，生長的適宜pH值為3～7。黑曲霉是重要的工業發酵菌種，在有機酸發酵和工業酶制劑方面有著廣泛的應用，同時在生物技術開展過程中發揮了很大的作用，很多產品來自于絲狀真菌的初級和次級代謝產物。由于美國食品和藥物管理局（FDA）已經認定許多來自黑曲霉的產物是安全的，所以黑曲霉被廣泛用于食品級產物的生產過程中。

代謝組學是指對生物體內一切代謝物進行定性定量分析，它是關于生物體系內源代謝物質種類、數量及其變動規律的科學，研究生物整體、系統或器官的內源性代謝物質及其與內在或外在因素的相互作用，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系，其在系統生物學研究中占據著極其重要的地位。代謝組學研究的物質大多數為相對分子質量在1 000以內的小分子物質。代謝組學是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學之后的系統生物學中另一個重要的組成部分，同時也是目前組學研究的熱門研究領域之一。代謝組學研究與轉錄組學和蛋白質組學研究相比，具有易于檢測、有數據庫、通用性強、結果直接、數據準確等優點；與轉錄組學和蛋白質組學相比，通過代謝物分析能夠更敏銳地分析環境擾動或脅迫對細胞的影響，因為在有些情況下環境的改變并不能影響細胞的轉錄水平和蛋白質水平，卻可以通過其代謝產物的變化而表現出來。由于對黑曲霉基因組學、轉錄組學、蛋白質組學的研究越來越清晰，進一步推動了黑曲霉代謝組學研究的發展，可靠的胞內代謝物組數據的獲取和代謝通量分析是揭示細胞真實代謝狀態的直接證據，對于提高代謝工程和工業發酵過程優化的理論和實踐水平也具有重要意義。本文對黑曲霉代謝組學研究方法及研究進展進行了概述，以期推進代謝組學在黑曲霉研究領域的應用。

1 黑曲霉代謝組學研究過程

作為新興的分子生物學技術，代謝組學技術已被廣泛應用在生物學的各個領域中。尤其在微生物領域中，該技術已取得了較大的進展。代謝組學技術應用高通量檢測方法對微生物體內的代謝產物進行分析，并對其代謝產物的代謝途徑進行研究整理。以Aspergillus和Penicillium為例，真菌細胞的次級代謝產物據估計達到10 000多種，但目前已知的代謝產物不足10%。本文以黑曲霉代謝組學研究為例，講述代謝組學研究方法中的樣品處理、代謝物分析鑒定和數據分析。

1.1 樣品處理

黑曲霉代謝組學研究要求黑曲霉的生長條件是能夠控制和重復的。必須嚴格控制溫度、pH、培養基組成、溶解O2和CO2等，以明確界定生長條件，建立標準的和可重復的參考培育條件。黑曲霉菌絲球在培養過程中會受到多種因素的影響，例如pH、孢子濃度、營養成分、培養條件、黑曲霉的生長狀態等。胡立明等人對黑曲霉產纖維素酶的液體發酵條件進行了研究，為進一步研究黑曲霉代謝組學提供了良好的培養基礎。

在黑曲霉代謝組學研究中對取樣的要求十分嚴格，要求快速取樣，這樣不僅能防止底物濃度發生巨大變化，而且還能保證黑曲霉的代謝產物維持穩定，為接下來的分析處理減少了影響。因此許多快速取樣設備應運而生，如BioScope裝置和Fast Swinnex Filtration（FSF）裝置等，均可實現樣品的快速采集。

與此同時，為了保證提取過程中代謝產物的完整性和真實性，要求在快速取樣后迅速對樣品進行淬滅以終止代謝反應。在淬滅過程中，要盡可能保證細胞的完整性并快速淬滅酶活力。液氮冷凍或高氯酸滅活技術是在動物和植物代謝組學研究中最為常用的2種滅活方法，但對于微生物的代謝組學研究，為了將胞內代謝物與胞外代謝物有效分離，則采用冷甲醇處理的淬滅方法，同時研究表明淬滅時用冷甲醇處理真核細胞的效果要好于處理原核細胞。目前這種方法在L.lactis、S.cerevisiae、E.coli、C.g lutam i2cum、A.niger、B.subtilis中均有應用。因此在絲狀真菌黑曲霉的代謝物淬滅時運用冷甲醇處理的方法在目前較為適用。

代謝物的提取是黑曲霉代謝組學研究中最為重要的步驟之一。代謝物的提取程度直接影響試驗的分析結果，因此在對代謝物進行提取時要求最大限度提取代謝物并且保證代謝物的完整性，不破壞或改變代謝物的相應理化性質。目前關于代謝物的提取溶劑有冷甲醇、熱乙醇、高氯酸或堿、熱甲醇、甲醇和氯仿混合液以及乙腈等。對于蛋白質應通過溶劑沉淀出來，如加入乙腈或甲醇使其變性；對于脂肪和脂質這類水不溶性的，可用2∶1的氯仿和甲醇混合液萃取得到?；诖罅垦芯勘砻?，出于對代謝物提取率的考慮，大多數提取方法采用熱乙醇提取。

1.2 代謝物的分析鑒定

代謝物的檢測、分析鑒定是代謝組學技術的重要組成部分。代謝物的分析平臺主要分兩類，分別是質譜（Mass Spectrometry，MS）和核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）技術分析平臺。對于代謝產物的檢測方法，一種新的多維分離技術如二級氣相色譜飛行時間質譜的檢測范圍更為廣泛，但由于其花費較大沒能得到推廣。對于氣相質譜聯用技術（GC-MS），此方法需要對揮發性較低的代謝物進行衍生化預處理，容易引起樣品的變化且花費的時間較長。液相質譜聯用（LC-MS）在檢測過程中無需對樣品進行預處理，這大大節省了檢測時間，也使得其在黑曲霉代謝學研究中得到廣泛應用。此外，毛細管HPLC-MS、UPLC-MS在微生物代謝組學研究中漸漸得到應用，明顯提高了分辨率、靈敏度和通量。目前市場上出現的AbsoluteIDQTM p180試劑盒，可同時鑒定和定量180種代謝物，包括氨基酸、生物胺、酰基肉堿、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、鞘磷脂和己糖總和（一種產生的代謝物）等，可廣泛用于代謝組學研究。AbsoluteIDQTMp180試劑盒通過與串聯質譜聯用的液相色譜（LC）分析氨基酸和生物胺，使用耦合到串聯質譜法的流動注射（FIA）分析其他代謝物，采用新挑選的內標和多重化合物反應監測（MRM）進行鑒定和定量。例如，這種試劑盒用于人類代謝組的第一個大規模全基因組關聯研究中鑒定和定量血清樣品中的163種代謝物以及研究酒精誘導的代謝組學差異。因此，開發更廣泛的標準化試劑盒對于定量代謝組學的進展是不可或缺的。

1.3 數據處理與分析

數據處理和數據分析是代謝組學研究的關鍵環節，需要對原始數據預先進行處理，消除相關干擾因素，從而得到代謝組學研究的可利用正確格式。代謝物組學分析從數據預處理開始，可根據質譜分析儀器所配套的軟件進行譜峰提取、譜峰對齊、歸一化和數據質量分析。對原始數據進行提取，以內標做參照，通過使用配套研發的專利軟件，對質譜峰進行對齊，得出校正后的數據，然后運用統計學方法，計算每種化合物在不同樣品組中差異的顯著性。常見的分析方法以PCA分析、PLS-DA分析和OPLS-DA分析為主。在對代謝物進行分析時也要參照相關的代謝組學數據庫，但就目前代謝組學相關研究數據來看，代謝組學數據庫仍不完善，因此需要更多的科研工作者共同努力構建完整的代謝組學數據庫。

2 代謝組學在黑曲霉領域的研究進展

近年來黑曲霉的代謝研究有顯著的發展，結合基因組學、蛋白質組學對代謝組學有了進一步的了解。在工業微生物領域，對于代謝組學的研究主要集中在酵母菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等微生物上。近期對黑曲霉代謝組學的研究報道較多，由于黑曲霉有豐富的代謝產物，目前基因簇所發現的化合物仍然有限，因此對黑曲霉代謝產物組的研究可從中發現新的代謝化合物，并能提高對代謝組學的認識。

2.1 黑曲霉代謝組學研究

在黑曲霉FGSC A1279次級代謝調控研究試驗中，通過對突變黑曲霉菌株進行代謝物的提取與檢測。選取全局性調控因子lae A缺失及過量表達菌株為研究對象，以硅膠柱色譜、正反相薄層板、葡聚糖凝膠柱SephadexLH-20和液相等色譜方法對黑曲霉（A.niger）lae A過表達菌株的乙酸乙酯萃取物進行分離，從中分離得到4種化合物。采用核磁共振譜、紅外光譜、質譜等譜學手段確定了羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸以及鄰苯二甲酸二異丁酯3種化合物的結構，除此之外還有一種化合物的結構待定。對所得到的化合物相關合成途徑進行了初步分析，為進一步研究黑曲霉次級代謝基因簇的調控提供了基礎數據。

此外基于13C代謝流和基因組規模代謝網絡模型的黑曲霉產糖化酶代謝調控機理研究，采用同位素稀釋法（IDMS）的代謝物組學和13C代謝流關聯分析技術研究了黑曲霉高產菌A.niger DS 03043和模式菌A.niger CBS 513.88的代謝差異及調控機制。發現黑曲霉高產菌A.niger DS 03043有相對較高的生長速率，產酶速率和糖耗速率以及較低的草酸和檸檬酸分泌速率。原因在于與野生型模式菌A.niger CBS 513.88相比，高產菌中胞內代謝流分布出現調整即更多的碳源流向了PP途徑而其三羧酸循環（TCA）途徑通量相對較低，從而使得糖化酶的產量得到提高。這一研究結果表明，黑曲霉中能量和還原力代謝在細胞主要代謝途徑通量分布調控中起著重要的作用。

在黑曲霉高產檸檬酸機制及代謝調控研究中，為進一步對黑曲霉產檸檬酸菌株進行遺傳轉化系統的建立，運用基因組學代謝組學相結合完成試驗。在對胞外代謝產物進行定量分析時，采用HPLC技術檢測胞外代謝產物。樣品經13 000 r/min離心5 min收集上清液，并用孔徑0.45 μm濾膜過濾，-20℃凍存。利用Amethyst C18-H色譜柱（Sepax technoligies，Inc.），以0.01%H3PO4為流動相，流速0.8 mL/min，溫度30℃，利用紫外檢測器在210 nm處進行檢測。結果表明細胞內任一酶過量均會造成細胞的損傷使胞外代謝產物增加。

2.2 鏈霉菌代謝組學研究

相比于黑曲霉代謝組學研究，鏈霉菌的代謝組學研究正逐漸走向成熟。在對灰色鏈霉菌JSD-1發酵工藝及代謝產物研究中，運用GC/TOFMS（Leco Corp.,St.Joseph，MI）對處理后的樣品進行測試，檢測到JSD-1菌體生長代謝1 000多個分離峰，然后利用SIMCA軟件進行PCA和OPLS分析。結果發現JSD-1生長代謝中轉化氨基酸的能力最強，這些前體物質一部分通過轉化成TCA循環的中間物質參與到菌體TCA循環中，一部分作為氮源直接被菌體吸收利用促進菌體的生長繁殖。

此外對于天藍色鏈霉菌代謝物組測定方法優化及其代謝特征中提到，以天藍色鏈霉菌為研究對象，對其代謝物組樣品制備方法進行了系統優化，并利用GC-MS分析平臺分析了該菌株的主要代謝特征。經檢測結果比對發現糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑（PPP）和三羧酸循環（TCA）在對數期有較高的代謝強度。在對鏈霉菌代謝組學研究的技術方法了解后，能夠更有效地為黑曲霉代謝組學研究提供可靠的技術參考。

2.3 黑曲霉代謝組學研究技術進展

在Francisca Lameiras等人的研究下，開發一種恒化器，用于常規渦輪攪拌生物反應器中進行黑曲霉均勻穩態培養和絲狀真菌的快速取樣，并且進行冷甲醇淬滅結合冷過濾的系統研究，使這種方法運用于代謝組學研究中。采用恒化器培養的黑曲霉生長均勻且菌絲不會出現附著培養器壁生長的現象。運用這種快速采樣裝置和高效的冷甲醇淬滅方法，同時結合快速冷卻過濾、快速采樣、收集和洗滌菌絲體，從而實現精確的定量代謝組學研究。研究發現在-20℃下，40%甲醇水溶液混合物能實現最小的代謝物泄漏?？傊?，通過這項技術能為進一步研究代謝組學和代謝物運輸研究作出貢獻。

3 問題與展望

目前，代謝組學日益成為科研工作者關注的熱點，國內外研究學者也逐漸對代謝組學的研究加以重視，然而代謝組學還面臨著許多問題有待于解決。①缺乏建立標準的滅活和代謝物提取方法，以及對滅活過程中引起的胞內代謝物泄漏問題的評價與分析方法。②在代謝物的檢測技術方面仍有缺陷，新的多維分離技術如二級氣相色譜分析時間譜的檢測范圍更為廣泛，但由于此方法檢測過程中的費用昂貴沒得到大規模的推廣；氣相質譜聯用技術（GC-MS）使用時，需要對有較強揮發性的代謝產物進行衍生化預處理，此過程消耗的時間過長且容易引起樣品發生一些化學變化。代謝產物分析平臺的缺乏，由于代謝產物的理化性質復雜，對分析平臺的要求十分嚴格，目前還沒有一個很好的分析平臺能夠完成。③隨著代謝組學的發展，對于代謝組學研究的數據庫并沒有得到很好的完善，包括代謝輪廓、代謝標志物等信息的缺乏。這些問題使得代謝組學的發展受到限制。同樣對黑曲霉代謝組學的研究，仍處于發展階段，在對黑曲霉復雜多樣的代謝產物進行分離、分析檢測方面仍存在技術缺陷，目前還沒能找到更為理想的技術方法，并且代謝組學研究數據庫有待于進一步完善。

隨著科學技術的發展，相信代謝組學技術也將會逐漸得到完善，黑曲霉代謝組學研究也將取得巨大的進步。代謝組學未來將開發出更靈敏、更廣譜、更通用的檢測方法，對各譜峰所對應的化合物結構進行鑒定，進而有助于全面闡釋細胞內部的工作機理；代謝組學與其他系統生物學組學技術緊密結合。基因與蛋白質的表達相聯系，而代謝組學能夠更好地反應細胞對營養和環境等外界因素的響應，通過與基因組學和蛋白質組學相結合進一步弄清楚生物機體的工作原理和相互之間的聯系。此外將代謝組學的研究運用在黑曲霉這類真菌上，能夠使復雜的代謝產物清晰的構建出其代謝網絡圖譜，并且能全面深入地揭示黑曲霉機體自身的調控能力，為今后黑曲霉的研究與利用提供更為可靠的數據。

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