壓力—溫度協同作用下華根霉脂肪酶的催化行為研究

陳 剛 繆 銘 江 波 馮 骉,

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

壓力—溫度協同作用下華根霉脂肪酶的催化行為研究

陳 剛1繆 銘2江 波2馮 骉1,2

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

研究了高壓處理中壓力和溫度對華根霉脂肪酶的活力和穩定性的影響，并利用活性酶?變性酶的雙態模型考察了酶的熱變性，并構建壓力—溫度二元相圖。研究結果表明：在0.1～200.0 MPa時，華根霉脂肪酶活力隨壓力提升而增加，其中在壓力200 MPa時酶活達到最高值，是常壓下初始酶活的116%；當壓力超過200 MPa時，酶活開始降低，尤其在400～600 MPa范圍內迅速降低。壓力—溫度協同作用下華根霉脂肪酶的加工穩定性數據顯示，在200 MPa、40 ℃下酶熱穩定性最佳，壓力超350 MPa時酶熱穩定性顯著降低。

高壓；脂肪酶；溫度；酶活；熱穩定性；催化行為；雙態模型

高靜壓(高壓)技術是一種非熱加工技術，有利于很好地保持和改善食品的功能和品質[1]。高壓技術的一項典型應用是滅菌[2]，20世紀90年代國外就有高壓處理果汁、肉制品等產品面市。高壓處理也能夠鈍化食品內源酶，這一特性已被嘗試應用于食品加工和保藏中。超高壓滅菌的效果受環境因素如溫度、pH、離子強度等的影響，有關此方面的研究已有相當積累[3]。環境因子的影響也體現在高壓處理對酶活性和穩定性的影響[4]，特別是溫度對酶的催化活性具有重要作用。

高壓環境對酶的活力能產生重要的影響[4-5]，這一現象可用于誘導調節酶活，脂肪酶可作為典型實例來研究[6]。脂肪酶屬于絲氨酸水解酶類，能夠打斷酯鍵而水解酯類，在微水的有機環境中則能催化醇、酸合成酯的反應，近年來非水相合成成為了酶工程的熱點[7]。研究[8-9]發現某些脂肪酶經高壓處理后活力有所提高，而有些脂肪酶則不存在此現象。本研究擬以華根霉脂肪酶(R.chinensislipase，RCL)為研究對象，考察其在壓力—溫度協同處理下的催化特性和穩定性變化，以期為調控與食品相關的酶類的催化行為提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

華根霉脂肪酶：1 100 U/mg，泰興一鳴公司；

酚酞、95%乙醇、聚乙烯醇、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

橄欖油：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

超高壓實驗設備：MICRO FOODLAB FPG5740型，英國Standerd Fluid Power公司；

循環水浴系統：HAAKE SC 100型，美國Thermo Scientific公司；

電熱恒溫水槽：DK-8D型，上海森信實驗儀器有限公司；

pH計：Delta 320s型，梅特勒-托利多儀器有限公司；

磁力攪拌器：HS7型，德國 IKA 公司；

精密天平：XS204型，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶活力的測定 底物溶液的配制：將40 g聚乙烯醇加入1 L去離子水中高溫攪拌溶解至無顆粒，待冷卻后用3層紗布過濾，得到4%聚乙烯醇溶液。將聚乙烯醇溶液和橄欖油以3∶1的體積比混合均質10 min，備用。

脂肪酶活力具體測定方法參見橄欖油乳化法[8]。除特別指出外，反應體系所用的緩沖溶液均為pH 7.5 的磷酸緩沖液；相對殘余酶活定義為測得的酶活與40 ℃、0.1 MPa下的酶活之比。

1.2.2 酶液的高壓處理 在高壓設備上設定壓力和加壓時間，以體積分數30% 1,2-丙二醇為傳壓介質，并通過循環水浴穩定試驗溫度。將盛有酶液的耐高壓密封管放入高壓腔內處理，高壓處理完畢后立即取出并測定酶活。

1.2.3 高壓處理對RCL活力的影響 將16 mg粗酶粉溶于500 mL pH 7.5的緩沖液，配制為適當濃度的酶液。將該酶液裝入耐高壓密封管中，分別在40 ℃下以100，150，200，300，400，500，600 MPa處理10 min,泄壓后立刻取出并測其相對酶活。

1.2.4 溫度對RCL活力的影響 將上述酶液分別在0.1 MPa 和200 MPa下以35，40，45，50，60，70 ℃溫度處理10 min。取出后立刻分別在40 ℃和相應溫度下測定酶活。在相應處理溫度下測定的酶活表示酶在給定壓力下處理后的活力與處理溫度間的關系，在40 ℃下測定的酶活表示酶經處理后的殘余活力。

1.2.5 壓力和溫度對RCL熱穩定性的影響 將上法配制的酶液(緩沖液改為Tris-HCl，pH 7.5)分別在不同溫度(40，50，55，60 ℃)下以0.1，200.0，350.0，400.0，450.0，500.0 MPa的壓力處理不同時間，泄壓后立刻取出并測其活力。

1.2.6 溫度—壓力協同作用下RCL的熱失活動力學 將上法配制的酶液(緩沖液改為Tris-HCl，pH 7.5)分別在10，15，20，25，30，35，40 ℃下以50，100，150，200，250，300 MPa處理10 min。40 ℃保溫3 min的6個樣品(4 mL底物溶液和5 mL濃度0.025 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl溶液混合制成)中依序加入0.9 mL處理后的脂肪酶酶溶液，計時。在反應2，3，4，5，6，7 min時分別加入15 mL 95%乙醇滅活，以50 mmol/L 的NaOH溶液滴定并記錄數據，以NaOH耗用量對時間作圖，用線性回歸法得到反應速率。

圖中所有數據均為多次重復試驗后的均值。

2 結果與分析

2.1 高壓處理后RCL活力的變化

圖1表示RCL的水解酶活在40 ℃、pH 7.5下隨壓力的變化情況。由圖1可知，該脂肪酶經0.1～200.0 MPa 處理后，其水解活力隨著壓力的提高而提高，在200 MPa 達到最大值，為常壓下原酶活力的116%，該壓力可當作此條件下該酶反應的最適壓力。當壓力高于200 MPa以后，RCL酶活開始下降，但直到壓力為350 MPa時仍高于常壓下的酶活。此后，隨著壓力的提高，酶活開始下降到100%以下；在400～600 MPa范圍內酶活顯著降低，說明此高壓下RCL快速失活。

大多數酶在高壓作用下易失活，Noel等[9]研究發現米黑毛霉脂肪酶在經過高壓處理后處于鈍化狀態。也有部分報道表明在合適的高壓處理后某些酶的酶活會得到提升，楊新穎等[8]發現在低于400 MPa的壓力作用下解脂耶氏酵母脂肪酶的活力會得到提高，而壓力超過500 MPa時則急劇下降。杜煥梅等[4]的研究結果與本研究相似，該研究發現在0.1～200.0 MPa時，皺褶假絲酵母脂肪酶的酶活隨壓力的提高而逐漸提高，當壓力超過200 MPa時開始下降，表明只有在合適的壓力范圍內才能提高酶的催化能力。李赟高等[3]報道在200 MPa時菊糖果糖轉移酶酶活提高了30%左右，并在600 MPa時明顯失活。趙偉等[1]發現在小于200 MPa的壓力作用下，牡蠣中的蛋白酶水解蛋白的活力顯著提高。Chen等[7]報道，米根霉脂肪酶與假絲酵母脂肪酶的酶活都隨著α-螺旋比例的提高而逐漸提升。劉苗等[10]發現高壓下菊糖果糖轉移酶酶活的變化與高壓誘導內源熒光變化存在相關性。這些現象說明經高壓處理后，酶結構的變化與酶活的變化有一定的關系。

2.2 在不同溫度下經高壓處理后的RCL活力的變化

固定壓力為200 MPa，在不同溫度下處理RCL并測定其活力，得到經給定壓力處理后酶的活力與處理溫度間的關系，見圖2。由圖2可知，200 MPa下脂肪酶RCL的相對酶活相對于常壓下的都有提高，兩條曲線幾乎是并行的。在兩種壓力下，該酶的最佳催化溫度均位于40～45 ℃，表明高壓對該酶的最佳催化溫度幾乎沒有影響。這與某些報道所觀察到的現象有所不同，楊新穎等[8]發現高壓處理后解脂耶氏假絲酵母脂肪酶的最適反應溫度偏移了5 ℃左右。在催化過程中，溫度不僅可提供酶催化反應所需要的能量，促使酶的催化能力提高或者降低；此外，壓力能夠改變酶的構象，因此不同壓力處理可能會使酶的最適催化溫度發生遷移。

經200 MPa和不同溫度處理后測定RCL在40 ℃下的活力，可得到RCL在處理后的殘余活力，同時也比較了常壓下的酶活力，見圖3。由圖3可知，在35～50 ℃時，不同溫度下200 MPa的壓力作用導致的RCL活力提升略有不同，造成了RCL的殘余活力輕微波動。隨著溫度繼續升高，由50 ℃到70 ℃時，RCL活力明顯下降，但下降速度慢于常壓下的速度。在處理溫度低于55 ℃時，該酶的殘余活力都高于初始酶活，表明200 MPa的壓力對該酶有保護作用。當溫度達到70 ℃時，殘余酶活仍有58%。而在0.1 MPa下該酶的活力隨溫度的提高快速下降，至70 ℃時已經完全失活。上述結果表明，最適壓力下不僅酶的催化性能得到提高，而且酶抵抗熱變性的能力也提高了。其它學者[3,10]也得到了相似研究結果，在200 MPa、60 ℃處理條件下，菊糖果糖轉移酶的殘余活力明顯提高。

2.3 壓力和溫度對RCL熱穩定性的協同作用

從上述研究可知，合適的高壓處理既能提高華根霉脂肪酶活力又有助于提高其耐熱性，而過高壓力則會引起脂肪酶的鈍化。研究[3]發現離子強度會影響酶的活力和穩定性。為排除鹽離子的影響，試驗選取Tris-HCl (pH 7.5)作為緩沖液。

在200，500 MPa下溫度對脂肪酶熱穩定性的影響見圖4。總體而言，兩種壓力下熱穩定性皆隨溫度的提升逐漸降低。圖4(a)表明，在200 MPa、40 ℃下保壓1 h后，脂肪酶殘余活力仍保持在原酶的100%左右，熱穩定性很好。在溫度提升到50 ℃時，其熱穩定性略有降低。當提升到55 ℃以上，殘余酶活則顯著降低，熱穩定性明顯變差。這表明即使在最適壓力下，脂肪酶在較高溫度下的熱失活作用仍不可避免。盡管在50 ℃時200 MPa的壓力可以明顯改善酶的催化能力并提高酶的穩定性，但當溫度提升到60 ℃時酶的失活速率明顯增加。圖4(b)顯示了500 MPa下RCL的熱穩定性，酶活在最佳催化溫度下仍急劇下降，表明該酶熱穩定性變差。有報道[6,11]指出，表面壓力誘導的酶鈍化伴隨著酶蛋白中更多的疏水區域暴露于水溶液中，在一定程度上會促進熱失活。因此500 MPa的壓力處理將使酶熱穩性變差。

結果顯示，在壓力200 MPa、溫度40～55 ℃時，RCL活力與處理時間呈線性關系；而當溫度超過55 ℃時則呈曲線關系，這種現象也在其他脂肪酶的高壓熱穩定性行為中被觀察到。Noel等[9]報道經過同樣的高壓處理，40～50 ℃時米黑毛霉脂肪酶的殘余活力與處理時間呈線性關系，而在55～60 ℃時呈非線性關系，研究發現壓力的介入使得熱失活發生改變。通常認為酶的熱失活速率服從一階微分方程，在半對數坐標中活力與時間為線性關系。但高壓下RCL的熱失活速率顯然不服從一階微分方程，表明高壓下熱失活的動力學發生了改變。從圖4(b)可知，酶活與處理時間呈非線性關系，說明壓力較高時，壓力會加快該酶的失活，這與本研究觀察到在500 MPa下RCL折疊展開而失活的現象相一致。

50 ℃下壓力對RCL熱穩定性的影響見圖5 (a)。由圖5可知，只有200 MPa的處理才能顯著改善RCL的熱穩定性；而在350 MPa下處理時，盡管酶的催化活性并不低于0.1 MPa下的，但熱穩定性依然變差，并且隨著壓力的提高變得越來越差。

圖5與圖4(a)中的曲線有相似之處，當壓力升高到一定程度后，RCL活力與時間的關系開始由直線轉變為曲線，說明酶的熱失活動力學改變了，這對于超高壓加工技術在食品殺菌與鈍化酶中的應用有重要啟示。60 ℃下壓力對RCL熱穩定性的影響與圖5(a)趨勢相同，只是在相同壓力下酶的失活速率加快，在350 MPa下RCL活力與時間的關系已經呈曲線關系。而壓力超過400 MPa時，RCL活力下降明顯加快。該結果表明一定壓力下壓力和溫度共同促進了酶的熱失活。

Boulekou等[12]發現在700 MPa、50 ℃處理1 min后，桃漿中的果膠甲酯酶殘余活為80%左右；但在60 ℃下，果膠甲酯酶已經明顯失活，該酶的殘余活力降為40%。曾慶梅等[13]報道過氧化物酶活力與β-折疊有關，高壓處理會減少該酶二級結構中的β-折疊含量，由此誘導酶失活；而溫度與高壓的共同作用會導致β-折疊含量減少，進而促使酶活下降。另一方面，Noel等[9]則發現即使在水相體系中超高壓也可以提高R.miehei脂肪酶的穩定性，而且在達到變性溫度50 ℃時，高壓(50～350 MPa)能夠保護脂肪酶的結構，并且隨著溫度的提高，這種保護效應越來越明顯。這些研究表明高壓—溫度協同作用可能是通過酶構象的改變來調節酶催化行為。

2.4 溫度—壓力二元作用下的熱變性動力學

上述研究結果表明，對于壓力和溫度共同作用下酶的穩定性，兩者既可能表現為相互拮抗，也可能表現為相互促進，其中的解釋與熱變性動力學有關。

如果把酶的熱失活(本質上是蛋白質的熱變性)假設為一個雙態模型：活性酶?變性酶，這個過程的平衡常數Keq可以用下列公式表示：

(1)

式中：

[E]A、[E]D——分別表示活性酶與變性酶的濃度，mol/L；

[E]max——活性酶濃度的最大值，mol/L。

根據米氏方程，酶反應速率可以寫為：

(2)

若[S]?Km，則Km可以被忽略，此時反應速率接近于恒定值，反應為零級反應：

(3)

本研究中，酶活的測定均在常壓、40 ℃下進行，k值恒定，因而反應速率v與活性酶濃度[E]成正比，式(1) 可以寫成：

(4)

式中：

vmax——最適溫度或壓力下對應的反應速率，μmol/(mL·min)。

若活性酶?變性酶的可逆變化處于平衡時，變性酶的含量為零，則Keq的值為0，由式(4)可推得v=vmax。找到常壓下反應速率vmax的值所對應的溫度值或者一定溫度下反應速率vmax的值所對應的壓力值即可得到100%活性酶的溫度—壓力二元相圖。

本研究證實試驗條件下RCL催化的橄欖油水解速率與底物濃度無關，并由此得到了vmax。本研究測定了RCL在不同溫度及壓力處理下的反應速率，vmax所對應的溫度分別為10，15，20，25，30，35，40 ℃；而其所對應的壓力分別為50，100，150，200，250，300 MPa，從而得到溫度—壓力二元相圖，見圖6。

圖6中的橢圓代表了活性酶和變性酶的平衡。當溫度和壓力均位于橢圓之內，酶將處于活性狀態；而當溫度和壓力處于橢圓外部時，酶則處于失活狀態。由圖6可知，對于右半支曲線上的A點，當壓力提高時，同時需要進一步提高溫度，才能使酶失活，說明溫度和壓力對酶活的影響存在拮抗效應，壓力的提高可以將酶于高溫下的穩定性提高。因此，可以通過適當的壓力處理來改善酶的穩定性。

在高于42 ℃的溫度下，改變壓力已無法使該酶的狀態回到橢圓內，此時，隨著溫度的提升，酶的狀態偏離橢圓曲線的程度不斷加劇，說明壓力已經不足以抵抗熱變性導致的酶構象變化。而當壓力超過325 MPa時，也使酶的狀態不斷偏離橢圓曲線，壓力的提升開始對酶的結構產生破壞，壓力和溫度之間表現為相互促進。

3 結論

高壓處理能夠改變華根霉脂肪酶的活力，但壓力過高會引起該酶的失活，200 MPa是最適處理壓力，在此壓力下處理可使RCL的活力提高16%。高壓處理并未改變RCL的最佳催化溫度。另一方面，即使在最佳壓力下，該酶的熱失活現象依然存在。壓力—溫度協同作用下RCL的熱穩定行為表明：200 MPa處理能夠顯著改善RCL的熱穩定性，而較高壓力將改變RCL的熱失活動力學。在0.1～200.0 MPa范圍內壓力和溫度之間存在拮抗效應，而當壓力超過350 MPa后高壓處理反而降低了RCL的熱穩定性，即壓力和溫度之間呈現促進效應。建立活性酶?變性酶的雙態模型考察了RCL的熱穩定性，本研究測得的橢圓曲線符合熱力學理論推導的結果，同時也可以解釋壓力和溫度協同作用下RCL的熱穩定性行為。

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Study on catalytic behaviors ofRhizopuschinensislipase under synergic action of high pressure and temperature

CHEN Gang1MIAOMing2JIANGBo2FENGBiao1,2

(1.SchoolofFoodScience,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 2.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

The effects of pressure and temperature on the activity and the stability ofRhizopuschinensislipase during high hydrostatic pressure treatment were studied. Based on the two-state model, the thermal denaturation of the enzyme was investigated and the isokineticity diagram was obtained. Within 0.1～200.0 MPa the enzyme activity increased with the pressure and the maximum activity was achieved at 200 MPa, which was 116% of that at atmospheric pressure. The activity began to decrease at pressure above 200 MPa and this tendency accelerated upon the pressure superior to 400 MPa. The high pressure treatment did not modify the optimal temperature of the enzyme. The enzyme exhibited the highest stability when it was treated at 200 MPa and 40 ℃. Its stability declined obviously when it was treated under pressure above 350 MPa. The above behavior could be explained by the isokineticity diagram.

high hydrostatic pressure; lipase; temperature; relative activity; thermostability；catalytic behavior；two-state model

教育部博士點基金(編號：20130093110010)

陳剛，男，江南大學在讀博士研究生。

馮骉(1953—)，男，江南大學教授，博士生導師，博士。 E-mail：bfeng@jiangnan.edu.cn

2017-01-20

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.001