基于酸水解法釀酒糯高粱與粳高粱結合態(tài)香氣研究

呂佳慧范文來 徐 巖

(1. 教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學生物工程學院釀造微生物與應用酶學研究室，江蘇 無錫 214122)

基于酸水解法釀酒糯高粱與粳高粱結合態(tài)香氣研究

呂佳慧1,2范文來 徐 巖

(1. 教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學生物工程學院釀造微生物與應用酶學研究室，江蘇 無錫 214122)

為探索糯高粱和粳高粱對釀酒品質的影響，采用固相萃取吸附前體物質、酸水解釋放揮發(fā)性成分，應用HS—SPME結合GC—MS定性、定量高粱結合態(tài)香氣成分。在兩種高粱中共檢測到21種結合態(tài)香氣物質(其中3種為臨時性鑒定的)，包括5種醇類、7種醛酮類、5種芳香族、3種萜烯及降異戊二烯類和1種呋喃類化合物。研究發(fā)現，糯和粳高粱結合態(tài)香氣化合物總量分別為7 192，6 922 μg/kg，糯高粱水解后香氣化合物總量比粳高粱高3.90%。含量差異較大的是醛酮類化合物，其次是萜烯及降異戊二烯類化合物。2,2,6-三甲基環(huán)己酮、TDN、異佛爾酮首次在高粱結合態(tài)香氣中檢測到。

糯高粱；粳高粱；結合態(tài)風味；頂空固相微萃取

結合態(tài)香氣(bound aromas)是不揮發(fā)的糖苷類前體(常見的是O-β-D-糖苷或O-雙糖苷)在酸解或酶解條件下釋放出的具有香氣的揮發(fā)性成分(見圖1)。來源于原料的風味物質主要是以結合態(tài)的、不揮發(fā)性的、無氣味的糖苷形式存在與積累于植物中[1]。國外已對釀酒葡萄結合態(tài)風味進行了廣泛研究，形成了一整套包括檢測方法[2]、風味組成[3]和風味修飾機制[4]等技術。學者[5]發(fā)現甘薯中存在結合態(tài)形式的里哪醇(linalol)、香葉醇(geraniol)、橙花醇(nerol)和松油醇(α-terpinol)，且單萜醇對甘薯燒酒的風味有一定的感官貢獻。

白酒是以谷物為原料，經蒸煮、糖化、酒曲發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌而成的傳統(tǒng)蒸餾酒。白酒釀造原料以高粱為主，玉米、小麥、豌豆等也可作為釀酒原料。

高粱是中國白酒生產的主要原料，釀酒常用的高粱有雜交粳高粱和糯高粱兩種。中國研究人員更多關注釀酒高粱的理化特性如淀粉、脂肪和單寧等物質含量[6]以及其對白酒產量和質量的影響[7]，而原料高粱對白酒風味的影響以及高粱結合態(tài)風味的相關研究極少。早期曾經研究過雜交粳高粱與糯高粱的釀酒特性[8-11]；也對高粱蒸煮后的香氣進行過初步研究[12]。前幾年，研究人員[13]基于酸水解法研究了高粱、玉米、大麥、小麥、大米、糯米6種谷物原料的結合態(tài)香氣，檢測到35種揮發(fā)性成分，并比較了6種谷物香氣的差異，但未涉及糯高粱與粳高粱的結合態(tài)香氣。

為更好地了解釀酒糯高粱與粳高粱結合態(tài)香氣，本研究擬采用C18固相萃取小柱吸附前體物質，酸水解釋放風味物質，結合HS—SPME—GC—MS技術研究高粱的結合態(tài)香氣組成，以期從結合態(tài)香氣角度了解高粱對白酒風味的貢獻。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

紅纓子糯高粱：貴州某酒廠；

雜交粳高粱：山東某酒廠；

NaCl、鹽酸、Na2HPO4、檸檬酸、NaOH：分析純，上海國藥集團；

乙醇、甲醇、表 1中鑒定出的18種化合物標準品：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 主要儀器設備

氣相色譜質譜聯(lián)用儀：GC 6890N-MSD 5975型，美國Agilent 公司；

自動進樣器：MPS2型，德國Gerstel公司；

DVB/CAR/PDMS萃取頭：57329-U Supelco 50/30 μm，美國Supelco公司；

FFAP毛細管柱：60 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Supelco公司；

Supelco固相萃取裝置：Visiprep DL型，美國Supelco公司；

LC-C18固相萃取小柱：2 g/10 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 結合態(tài)香氣前體提取和分離 根據文獻[14]修改如下：2 g高粱樣品用30 mL乙醇提取，37 ℃搖床過夜，轉速200 r/min，過濾；30 mL甲醇相同條件再次提?。缓喜⑻崛∫海?5 ℃旋轉蒸發(fā)，用30 mL 超純水復溶，12 000 r/min離心30 min，取上清液。固相萃取操作：10 mL色譜級甲醇活化C18柱子；10 mL超純水平衡柱子；上清液上樣；90 mL超純水去除糖和酸；5 mL色譜級甲醇洗脫。收集洗脫液，緩慢氮吹至干。

1.2.2 結合態(tài)香氣前體酸解 10 mL復溶的緩沖液用鹽酸調至pH為1，100 ℃反應1 h，反應完用固體NaOH調至pH為7(在冰浴中進行)，保證溶液體積不變。

1.2.3 HS—SPME—GC—MS分析 根據文獻[15]修改如下：準確吸取8 mL酸解液于頂空瓶中，加入3 g NaCl和5 μL 濃度81.90 mg/L的內標2-辛醇溶液，旋緊瓶蓋，進行HS—SPME—GC—MS分析。

色譜條件：載氣He，流速2 mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL；色譜柱DB-FFAP(60 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度50 ℃，2 min后以4 ℃/min 升溫至230 ℃，保持15 min[15]。HS-SPME條件：DVB/CAR/PDMS三相萃取頭，45 ℃預熱2.5 min，吸附45 min直接進樣，GC解吸5 min。質譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，全掃描模式。

1.2.4 酸解產物定性定量分析 定性：化合物通過NIST 05.L庫的標準圖譜及標準品的保留指數(RI)比對定性；沒有標準品的化合物，參考文獻[16]RI定性。定量：化合物稀釋成一系列濃度的標準溶液，內標為2-辛醇，HS—SPME—GC—MS分析，用選擇離子法(SIM)計算化合物峰面積，以化合物與內標物的峰面積比為橫坐標、質量濃度比為縱坐標建立標準曲線。其中，1,3,5-三甲基苯、2,5-二甲基苯甲醛和1-十二醇為臨時性鑒定、半定量，化合物的質量濃度是內標的質量濃度、化合物與內標的峰面積比的乘積。

檢測限(LOD)為3倍信噪比時物質的質量濃度；定量限(LOQ)為10倍信噪比時物質的質量濃度?；厥章拾词?1)計算：

(1)

式中：

R——回收率，%；

Cx——在樣品中添加一定濃度標準品后檢測到的化合物的質量濃度，μg/L；

C0——在樣品中不加入標準品時所能檢測到的化合物的質量濃度，μg/L；

Cs——添加的標準品的質量濃度，μg/L。

2 結果與討論

2.1 結合態(tài)香氣物質定性和定量

參考葡萄前體物質酸水解、釋放結合態(tài)香氣物質的最優(yōu)條件[3]，采用100 ℃，pH 1的條件水解高粱結合態(tài)香氣前體物質。水解后GC—MS測定結果表明，在糯高粱和粳高粱酸水解液中共鑒定出21種化合物，包括5種醇類、7種醛酮類、5種芳香族、3種萜烯及降異戊二烯類和1種呋喃類化合物(見圖 2)。

21種物質中，除了1,3,5-三甲基苯、2,5-二甲基苯甲醛和1-十二醇為臨時性鑒定、半定量，其余18種物質建立標準曲線(見表 1)，R2為0.980 7～0.999 7，線性良好；回收率在85%～113%，RSD在8%以內，適于結合態(tài)香氣物質的定量。

2.2 糯高粱與粳高粱結合態(tài)香氣物質分析

從水解液檢測結果看，醇類和醛酮類是糯高粱和粳高粱結合態(tài)香氣物質中含量較豐富的化合物，醇類化合物含量占糯高粱和粳高粱結合態(tài)香氣物質總量的28.75%和29.14%，醛酮類化合物占28.79%和28.16%，其次是萜烯及降異戊二烯類化合物。從單個化合物含量來看，2-乙基己醇的含量最高，其次是β-苯乙醇、1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘(TDN)。

1. 已醛 2. 壬醛 3. 反式-2-壬烯醛 4. 反式-2-辛烯醛 5. 苯甲醛 6. 辛醛 7. 庚醛 8. 2,5-二甲基苯甲醛 9.β-大馬酮 10. 異佛爾酮 11. 苯乙酮 12. 2,2,6-三甲基環(huán)己酮 13. TDN 14. 1,3,5-三甲基苯 15. 2-戊基呋喃 16. 2-乙基己醇 17. 1-辛醇 18. 1-辛烯-3-醇 19.β-苯乙醇 20. 正己醇 21. 1-十二醇 IS. 2-辛醇(內標)

圖2 高粱酸水解后揮發(fā)性物質GC—MS總離子流圖(TIC)

Figure 2 GC—MS total ion current (TIC) chromatogram of sorghums’ volatiles after acid hydrolysis

糯高粱和粳高粱結合態(tài)香氣物質中檢測到5種醇類化合物。其中，2-乙基己醇含量最高，糯和粳高粱中含量分別為1 147 μg/kg和1 085 μg/kg。正己醇、1-辛烯-3-醇是常見的糖苷前體水解產生的脂肪醇類物質[17]。糖苷前體酸水解的斷鍵方式是醚鍵(見圖1)，形成碳正離子[18]，與氫氧根結合生成醇類化合物。

醛酮類化合物種類較豐富，檢測到6種醛類和1種環(huán)酮類化合物。其中，反-2-辛烯醛含量最高，糯和粳高粱中含量分別是558.9 μg/kg和527.5 μg/kg。而反-2-壬烯醛是豉香

型白酒的關鍵香氣，糯和粳高梁含量分別是381.0 μg/kg和359.1 μg/kg。醛類化合物可能是酸水解過程中的氧化產物[17]。2,2,6-三甲基環(huán)己酮呈薔薇花香，首次在高粱的結合態(tài)香氣中檢測，糯和粳高粱中含量分別是85.34 μg/kg和81.30 μg/kg。該化合物被認為是類胡蘿卜素的降解產物。

芳香族類化合物分別占糯和粳高粱結合態(tài)香氣總量的18.44%和18.75%。其中，β-苯乙醇含量最高，糯和粳高粱中含量分別是803.4 μg/kg和792.9 μg/kg。β-苯乙醇呈甜香、玫瑰花香和蜂蜜香，白酒中的濃度0.06～9.26 mg/L[19]133，是豉香型白酒的重要香氣成分。苯甲醛廣泛存在于酒類產品中，呈櫻桃—杏仁蛋白軟糖的氣味[19]134，糯和粳高粱中含量分別是103.2 μg/kg和103.4 μg/kg。β-苯乙醇和苯甲醛是常見的結合態(tài)香氣物質。

兩種高粱結合態(tài)香氣物質中檢測到β-大馬酮、1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘(TDN)、異佛爾酮3種萜烯及降異戊二烯類(norisopreonids)化合物。其中，TDN含量最高，糯和粳高粱中含量分別是765.2 μg/kg和723.2 μg/kg。TDN被描述為汽油、煤油和柴油臭，是雷司令(Riesling)葡萄酒典型的老化風味，已在汾酒和郎酒檢測到。此外，在高粱結合態(tài)風味中還檢測到了TDN和異佛爾酮，二者來源于類胡蘿卜素的降解及重排[19]284。而β-大馬酮是清香型白酒的特征風味成分[19]299，糯和粳高粱中含量分別是256.7 μg/kg和264.0 μg/kg。在甘薯燒酒中，甘薯品種是決定釀造過程中β-大馬酮含量的重要因素[20]。

? a表示無標準品，為半定量結果

在糯高粱和粳高粱中，結合態(tài)香氣總量分別是7 192 μg/kg 和6 922 μg/kg(見表 2)，糯高粱含量比粳高粱高3.90%。含量差異較大的是醛酮類，糯高粱比粳高粱高6.21%。其次是萜烯及降異戊二烯類、醇類化合物，糯高粱高3.94%和2.53%。從單個化合物來看，糯高粱和粳高粱含量差異較大的是1-十二醇、2,5-二甲基苯甲醛，粳高粱1-十二醇含量比糯高粱高59.6%，2,5-二甲基苯甲醛高27.1%。而糯高粱的大多數化合物含量比粳高粱高，在這些化合物中含量差異較大的是1-辛烯-3-醇、苯乙酮，糯高粱中1-辛烯-3-醇含量比粳高粱高7.86%，苯乙酮高7.43%。此外，糯和粳高粱水解反應后的溶液顏色也存在一定的差異，分別呈棗紅色和黃色，可能是高粱多酚及水解產物不同而引起的。

3 結論

本研究采用HS—SPME—GC—MS定量了21種化合物。醇類和醛酮類是兩種高粱結合態(tài)香氣中含量較豐富的化合物，其次是萜烯及降異戊二烯類化合物。其中，醛酮類化合物種類較豐富，還檢測到了2,2,6-三甲基環(huán)己酮、TDN、異佛爾酮。

在糯和粳高粱的醇提酸解揮發(fā)性成分中，結合態(tài)香氣總量分別是7 192 μg/kg和6 922 μg/kg，含量差異較大的是醛酮類化合物，其次是萜烯及降異戊二烯類、醇類化合物。單個化合物來看，糯和粳高粱含量差異較大的是1-十二醇、2,5-二甲基苯甲醛。本研究探討了酸性環(huán)境下糯高粱和粳高粱的結合態(tài)香氣的差異，為原料對白酒的風味貢獻研究提供了新的思路。原料結合態(tài)香氣的來源包括糖苷和類胡蘿卜素，因此筆者后續(xù)將對高粱的結合態(tài)香氣產生途徑和來源進行探究，進一步了解釀造原料對白酒酒質的影響。

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Research of bound aromas based on acid hydrolysis in glutinous and non-glutinous sorghums

LU Jia-hui1,21,2FANWen-lai1,21,2XUYan1,2

(1.LabofBrewingMicrobiologyandAppliedEnzymology,Wuxi,Jiangsu214122,China; 2.KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

In order to explore the effect of glutinous and non-glutinous sorghums on Chinese liquor’s quality, the SPE column was used for adsorbing bound precursors, and then, which were hydrolyzed by acid to release volatile compounds. The HS-SPME coupled with GC-MS was employed to identify and quantify sorghums’ bound aroma compounds. 21 kinds of aroma compounds were detected in two sorghums, including 5 alcohols, 7 aldehydes and ketones, 5 aromatic compounds, 3 terpenoids and 1 furan. Among these, 3 volatiles were identified tentatively. The total content of glutinous and non-glutinous sorghums’ bound aromas was 7 192 μg/kg and 6 922 μg/kg. The content of aroma compounds in the glutinous sorghum was 3.90% higher than in the non-glutinous sorghum and major differences of these compounds were aldehydes and ketones followed by terpenoids. 2,2,6-trimethylcyclohexanone, TDN, isophorone were first detected in sorghums’ bound aromas.

glutinous sorghum; non-glutinous sorghum; bound aromas; HS-SPME

十三五國家重大專項(編號：2016YFD0400500)；國家高技術研究發(fā)展計劃(863 計劃)(編號： 2013AA102108)

呂佳慧，女，江南大學在讀碩士研究生。

范文來(1966—)，男，江南大學研究員。 E-mail：wenlai.fan@163.com

2017—01—16

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.003