濃香型白酒糟醅中農藥降解菌的篩選及多樣性分析

馮瑞章周萬海 游 玲 魏 琴 舒 媛

(1. 宜賓學院生命科學與食品工程學院學院，四川 宜賓 644000；2. 固態發酵資源利用四川省重點實驗，四川 宜賓 644000)

濃香型白酒糟醅中農藥降解菌的篩選及多樣性分析

馮瑞章1,2周萬海 游 玲 魏 琴 舒 媛

(1. 宜賓學院生命科學與食品工程學院學院，四川 宜賓 644000；2. 固態發酵資源利用四川省重點實驗，四川 宜賓 644000)

通過富集培養和平板初篩，從濃香型白酒糟醅中分離篩選可降解農藥的微生物菌株，并進行16S rRNA 基因序列系統發育分析。結果顯示：52株分離菌株中，可降解丙環唑、莠去津和2,4D丁酯的菌株分別為25，10，17株，其中51株菌分屬于Bacillus、Lysinibacillus、Pseudomonas、Acinetobacter、Brevibacillus和Stenotrophomonas6個屬的22個模式菌株，1株菌與B.thuringiensis的序列相似度為97.3%，可能是該菌株的變種；Bacillus是可以降解3種農藥的共有屬和優勢屬(37株，占總菌數的71.2%)，Stenotrophomonas和Brevibacillus分別為降解莠去津和2,4D丁酯的特有屬。

白酒糟醅；農藥降解菌；篩選；多樣性

農藥殘留是農藥吸附、降解、遷移等多種因素綜合作用的結果，其中降解是制約殘留量的關鍵因子[1]。為了降低農藥對食品和環境的影響，科學家們早就開始了農藥降解行為的研究，張寧[2]2006年報道臭氧可降解蔬菜中多種農藥的殘留。研究[3]表明，因微生物對農藥的降解具有反應條件溫和、反應速度快和反應專一性強等特點，對環境中的農藥降解起著關鍵作用。近年來，研究人員[4]已從自然界的土壤或污水中篩選出包括細菌、真菌、放線菌、藻類等可降解各類農藥的菌群；亦有研究[5]表明，農產品的發酵可有效降低或消除農藥殘留，表現出潛在降解農藥的作用。以固態發酵為典型特征的濃香型白酒，其釀造過程中復雜的微生物群落對產品的質量和酒體風格有至關重要的作用，目前關于濃香型白酒微生物的研究主要涉及微生物群落組成及變化、功能微生物在提高產量方面的應用，但對于農藥降解微生物的研究未見報到。

本研究擬選用小麥、玉米、高粱等濃香型白酒生產原料種植中廣泛使用的莠去津、丙環唑和2,4D丁酯農藥，通過糟醅噴藥、誘發降解菌、采集糟醅進行農藥降解菌的分離和篩選，并對其發育多樣性和農藥降解能力進行研究，旨在為中國白酒生產過程的安全監控和風險預測提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 糟醅和藥劑

糟醅：采自宜賓規模以上濃香型白酒生產企業；

莠去津(99%)、丙環唑(98%)、2,4D丁酯(95%)：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 培養基

基礎培養基：K2HPO42.4 g/L，KH2PO41.2 g/L，NH4NO31 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.025 g/L, Fe2(SO4)30.008 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0～7.2；

富集培養基：基礎培養基中添加一定濃度的農藥；

純化培養基：蛋白胨5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖10 g/L，MgSO4·7H2O 0.03 g/L，CaCl2·2H2O 0.003 g/L；蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 富集培養 將50 mL富集培養基裝入250 mL的三角瓶中，滅菌后加入丙環唑原藥，使丙環唑含量為100 mg/L，加入糟醅樣品10 g搖床培養7 d(30 ℃，160 r/min)，按體積比1∶10的接種量轉接到含丙環唑濃度為200 mg/L的富集培養基，相同條件培養 7 d。連續轉接5次，直至培養基中莠去津濃度為500 mg/L。相同的方法富集培養莠去津和2,4D丁酯降解菌株。

1.2.2 菌種分離純化 取富集培養5次后的菌懸液0.2 mL，稀釋至10-5，10-6，10-7，涂布于含有100 mg/L丙環唑的基礎培養基平板上，28 ℃培養3～4 d。根據形態、色澤、大小特點挑取單個菌落接種至純化培養基上28 ℃培養24 h，再將菌落劃線培養，至單菌落生成。同法分離純化莠去津和2,4D丁酯菌株，不同農藥菌株分別編號。

1.2.3 農藥降解菌的篩選 將純化、編號后的菌株接種于含有100 mg/L丙環唑的固體基礎培養基上，28 ℃培養2～3 d，轉代培養于丙環唑含量為200 mg/L的培養基，繼續轉代3次，培養基中丙環唑濃度增至500 mg/L時還能生長良好的菌株，即為具有丙環唑降解潛能的菌株。同法篩選具有莠去津和2,4D丁酯降解潛能的菌株。

1.2.4 DNA提取與PCR擴增 參照文獻[6]的方法提取各菌株的總DNA、擴增16S rRNA基因片段。引物27f：5-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3和 1541r：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。擴增產物由上海生物工程技術服務有限公司(Sangon)純化測序(長度700～900 bp)，所有序列在GenBank注冊。

1.2.5 系統發育分析 所得序列用EzTaxon Server 2.0[7]在線進行相似性分析。用ClustalX程序按照最大同源性的原則進行比對，采用 Kimura-2[8]計算序列相似值，并用BioEdit 5.0.9 進行檢驗；Mega 4.0軟件進行系統進化樹的構建、編輯與保存。

2 結果分析

2.1 農藥降解菌的分離篩選

通過富集馴化，在3種含有供試農藥的基礎培養基上，共分離純化得到132株細菌的純培養物，其中可利用丙環唑、莠去津、2,4D丁酯的菌株分別為37，53，43株(表1)。 將上述菌株轉代培養于農藥濃度逐漸增加的固體平板培養基上，當莠去津、丙環唑和2,4D丁酯的濃度達到500 mg/L時，長勢良好的菌株共52 株，其中，在丙環唑培養基上25 株、在莠去津培養基上有10株、2,4D丁酯培養基上17株，分別占初分離菌株數的18.9%，67.6%，39.5%。

2.2 系統發育分析

由圖1可知，52 株供試細菌中，1株菌(菌株代號：XQB-33)的對應序列與Bacillusthuringiensis的相似性為97.3%，根據微生物16S rRNA 基因序列時相似度大于98%可認定為同一個種，相似度大于97%可認定為同一個屬的理論[9-10]，可認定該菌株為B.thuringiensis菌株的變種或與其親緣關系較近的其它種。除XQB-33菌株外，其余51 株菌與6個屬的22個種的模式菌株對應序列相似度大于98%，其中37株菌屬于Bacillus，占總供試菌株總數的71.2%，7株屬于Lysinibacillus，3株屬于Acinetobacter，2株屬于Pseudomonas，2株分別屬于Stenotrophomonas和Brevibacillus。以上結果表明濃香型白酒糟醅中可降解農藥的微生物菌株表現一定的系統發育多樣性，其中Bacillus是降解農藥的主要和優勢微生物。

2.3 降解不同農藥菌株的種屬分布

分析降解不同農藥菌株的種屬分布特征(表2)發現，能夠降解丙環唑的25株細菌中，有22株分屬于Bacillus的10個種，其中與模式種BacillusanthracisATCC 14578(T)的序列相似度大于98%的有12株，與B.oceanisediminisH2(T) 的序列相似度大于98%的有2株，與其它8個種相似度大于98%的菌株各有1株； 剩余2株與LysinibacillusmacroidesLMG 18474(T)屬于同一微生物種群，1株與PseudomonasazotoformansIAM1603(T)的相似度大于98%。

能夠降解莠去津的10菌株中，5株屬于Bacillus的3個模式菌株，其中與B.anthracisATCC 14578(T)序列相似度大于98%有3株，1株與B.mycoidesATCC 6462(T) 序列相似度大于98%，1株與B.thuringiensisATCC 10792(T)的序列相似度為97.3%，可能是該模式種的一個變種或與其親緣性很近的其它種；3株與Acinetobacter屬的2個模式種的同源性大于98%，另外2株分別與Pseudomonas和Stenotrophomonas屬的菌株同源性大于98%。

17株可降解2,4D丁酯的菌株中11株與Bacillus的6個模式菌株同源性超過98%，占到降解該農藥總菌株數的64.7%，4株與LysinibacillusmacroidesLMG 18474(T)為同一菌株，另外2株分別與AcinetobacternosocomialisLMG 10619(T)和BrevibacillusparabrevisIFO 12334(T)為同一菌株。

以上結果表明，在宜賓白酒糟醅中，能夠降解丙環唑的細菌有Bacillus、Lysinibacillus和Pseudomonas3個屬，能夠降解莠去津的細菌有Bacillus、Acinetobacter、Pseudomonas和Stenotrophomonas4個屬，可以降解2,4D丁酯的菌株有Bacillus、Lysinibacillus、Acinetobacter和Brevibacillus4個屬，其中Bacillus是可以降解3種農藥的共有屬，也是降解各種農藥的優勢屬，Stenotrophomonas和Brevibacillus分別為降解莠去津和2,4D丁酯的特有屬。

3 結論

微生物降解農藥具有投入低、無毒、無殘留、無二次污染的優勢，治理效果也相對明顯，是目前公認的低成本且環境友好型去除污染物的方法[11]。目前已經分離得到一批能降解或轉化某種農藥的細菌、真菌、放線菌等微生物，其中細菌因生化上的多種適應能力及易誘發突變菌株而占主要地位[12]。本試驗通過富集培養，從宜賓濃香型白酒糟醅中分離篩選得到52株可降解農藥的微生物菌株，系統發育分析發現，51株供試菌株與6個屬22個種的模式菌株對應序列相似度大于98%， 1株菌與Bacillusthuringiensis的相似性為97.3%。Bacillus是可以降解丙環唑、莠去津和2,4D丁酯農藥的共有屬和優勢屬，Stenotrophomonas和Brevibacillus分別為降解莠去津和2，4D丁酯的特有屬，優勢種屬及特有種屬微生物的開發利用為中國白酒安全生產提供資源，也為后續繼續研究農藥降解菌及其酶活性的作用機制、有效應用現代生物技術改造或構建新的菌種提供資源。

? “-”代表沒有菌株分配。

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Selection and diversity of pesticide-degrading bacteria isolated fromZaopeiof Luzhou-flavor Liquor

FENG Rui-zhang1,22ZHOUWan-hai21,2YOULing1,21,2WEIQing1,21SHUYuan1

(1.CollegeofLifeScienceandFoodEngineering,YibinUniversity,Yibin,Sichuan644000,China; 2.Solid-StateFermentationResourceUtilizationKeyLaboratoryofSichuanProvince,Yibin,Sichuan644000,China)

The pesticide-degrading bacteria was isolated and selected fromZaopeiof Luzhou-flavor Liquor by the enrichment culture and plate separation technology, then the phylogenetic analysis of these strains were carried out by 16S rRNA gene sequence. The results showed that 52 strains were isolated fromZaopeiof Luzhou-flavor Liquor, and 25 strains had degradative capability for Propiconazol, and 10, 17 had degradative capability for, Atrazine, 2,4-D butyl ester respectively. 51 strains belonged to 22 species of 6 genera (Bacillus,Lysinibacillus,Pseudomonas,Acinetobacter,Brevibacillus,Stenotrophomonas), and 1 isolatewaspresumed to be variety ofBacillusthuringiensis(with 97.3% sequence similarity).Bacilluswas the shared and dominant genus for, degradation three kinds of pesticides (Propiconazol, Atrazine, 2,4-D butyl ester) with 37 strains (accounting for 71.2% of 52 strains).StenotrophomonasandBrevibacilluswas the specific genera for Atrazine and 2,4-D butyl ester degradation respectively.

Zaopeiof Luzhou-flavor Liquor; pesticide-degrading bacteria; selection; diversity

四川省教育廳項目(編號：13ZA0201)；發酵資源與應用四川省高校重點實驗室項目(編號：2010KFZ004，2011KFJ003)

馮瑞章，女，宜賓學院副教授，博士。

周萬海(1979—)，男，宜賓學院副教授，博士。 E-mail:wanhaizhou@126.com。

2016—12—22

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.004