米糠固態發酵工藝優化及其氨基酸變化

尹孝超 錢海峰 王 立 張 暉 齊希光

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

米糠固態發酵工藝優化及其氨基酸變化

尹孝超 錢海峰 王 立 張 暉 齊希光

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

對米糠進行固態發酵，研究其蛋白、脂肪、灰分和總糖含量的變化規律，以期找到一種有效深度開發米糠資源的方法。結果表明：蛋白和灰分含量相比于發酵前明顯增加，脂肪和總糖含量隨著發酵時間的延長逐漸降低。以真蛋白含量為響應值，對固態發酵條件進行響應面輔助優化，確定最佳發酵條件為溫度37 ℃，時間102 h，水分含量60%，初始pH 5.5，接種量20 mL/100 g，發酵米糠的真蛋白含量19.65%，比原米糠提高了41.88%。此外，對米糠的氨基酸組成進行分析，蛋氨酸和蘇氨酸占總氨基酸含量分別提高了73.92%和22.99%。

固態發酵；米糠；黑曲霉

米糠是稻谷在加工過程中產生的副產品，是由糙米經碾米獲得的，包含種皮、果皮、胚乳和糊粉層等。中國年產稻米超過2.0×108t，米糠產量在1.2×107t左右，因此米糠資源非常豐富[1]。米糠中含有豐富的營養物質，蛋白含量12%～16%，脂肪16%～22%，纖維含量8%～12%[2]，以及維生素、多糖等生理活性物質。其中米糠蛋白的營養價值可與動物蛋白相媲美，可溶性蛋白約占總米糠的70%，具有低過敏性，其氨基酸組成與FAO/WHO的推薦模式相接近[3-6]。米糠蛋白雖然營養價值高，但是天然米糠中的蛋白質與纖維素、半纖維素、植酸鈣等物質結合緊密，不易被利用[7]。而且米糠蛋白的提取和分離純化難度大，限制了米糠蛋白的工業化生產和應用[8]。在中國，米糠利用還停留在初級階段，被直接作為畜禽飼料，消化利用率低，導致米糠資源未能得到深度開發。近年來，隨著對米糠資源的開發，米糠油、米糠多肽、米糠多糖等產品陸續出現，米糠資源的開發利用越來越受到研究者的重視。

固態發酵產品的優點突出，例如：① 將植物蛋白轉變成優質的菌體蛋白[9]；② 生產效率高，不受自然條件限制[10]；③ 能夠調節動物腸道菌群結構，有助于改善消化系統[11]；④ 包含多種酶系，有利于消化吸收[12]；⑤ 設備簡單，投資少等[13]。黑曲霉菌株產生的酶系豐富且酶活高，如淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等，且生長速度快，是公認的無毒無害菌株[14]。目前，國內外對于固態發酵米糠的研究主要集中在靜態發酵米糠提取生理活性物質方面，對于發酵米糠中蛋白質的富集優化鮮有報道。試驗中的翻料可以起到降低物料溫度的作用，同時黑曲霉是好氧真菌，翻料可以促進體系中氣體的交換，更加有利于發酵的進行。

本試驗采用黑曲霉菌株固態發酵米糠，研究米糠成分在固態發酵過程的變化，并對發酵米糠中的蛋白富集進行響應面優化試驗，旨在制得一種高蛋白發酵米糠產品，以及為今后米糠在固態發酵方面的深度開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉(AspergillusnigerF0045)：江南大學微生物菌種保藏中心；

察氏培養基(活化培養基)：蔗糖 30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO41 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，調pH至 7.2；

穩定化未脫脂米糠：真蛋白含量13.85%，脂肪含量16.71%，灰分含量7.01%，總糖含量342.33 mg/g，益海嘉里糧油食品有限公司，過40目篩，貯藏于-20 ℃冰箱中；

試驗所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

消解儀：HYP-1008型，濟南海能儀器股份有限公司；

全自動凱氏定氮儀：K9860型，濟南海能儀器股份有限公司；

霉菌培養箱：BMJ-160型，上海博迅實業有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣凈化技術有限公司；

氨基酸專用高效液相色譜儀：Agilent1260型，日本島津公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS-50 SII型，上海博迅實業有限公司；

分析天平：BSA224S型，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；

鼓風干燥箱：DHG-9055A型，上海一恒科學儀器有限公司；

pH計：STARTER3100/F型，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵米糠菌種的制備 取保存的黑曲霉斜面菌種一環，接種到試管斜面培養基上，于28 ℃下培養6 d，待斜面長滿黑色孢子后，用無菌蒸餾水洗滌斜面，用接種環輕輕刮下孢子，收集孢子懸液，用無菌紗布過濾。用血球計數板計數，至少計數3次，取相近的3個值的平均值作為孢子濃度。調整孢子懸液濃度在4.0×105mL-1。

1.3.2 發酵米糠的方法 稱取穩定化米糠10 g于250 mL三角瓶中，加入蒸餾水調整基質水分含量至60%，瓶口用八層紗布覆蓋。放入滅菌罐121 ℃，20 min。滅菌完后取出，冷卻。加入5 mL已滅菌的營養液(KH2PO42 g/L，MgSO41.5 g/L，NH2CONH25 g/L溶于0.4 mol/L的HCl中[15])和2 mL孢子懸液，攪拌均勻。放置于34 ℃霉菌培養箱中，保持濕度90%，每隔24 h翻料和補水3 mL一次。發酵72 h后，置于60 ℃烘箱烘干至恒重，保存待測。

1.3.3 發酵米糠的成分測定方法 發酵米糠中的真蛋白含量測定參照胡艷麗[16]方法進行，用凱氏定氮法測定真蛋白含量(蛋白轉換系數設為6.25)。脂肪、灰分和總糖含量的測定分別按GB/T 14772—2008、GB 5009.4—2016和GB/T 15672—2009執行。

水解氨基酸含量測定：稱量100.0 mg樣品放入50 mL水解管中，加入8 mL 6 mol/L HCl溶液，充氮氣封管，放入120 ℃烘箱中水解22 h，水解完全后冷卻，加入4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和并用蒸餾水定容至25 mL，雙層濾紙過濾后，取1 mL濾液10 000 r/min離心10 min，取上清液400 μL上機進樣。

1.3.4 固態發酵對米糠成分的影響 研究固態發酵對米糠中蛋白、脂肪、灰分和總糖含量的影響。選擇在溫度34 ℃、接種量20 mL/100 g米糠、初始pH 5.5和初始水分含量60%的條件下進行米糠固態發酵，發酵結束后，將樣品放入60 ℃烘箱烘干至恒重，保存待測。測定方法見1.3.3。

1.3.5 發酵條件的單因素試驗設計

(1) 發酵溫度：在接種量1 mL，發酵時間96 h，裝料量10 g，初始pH 5.5，初始水分含量50%的條件下，考察發酵溫度(28，31，34，37，40 ℃)對發酵米糠真蛋白含量的影響。

(2) 接種量：在發酵溫度28 ℃，發酵時間96 h，裝料量10 g，初始pH 5.5，初始水分含量50%的條件下，考察接種量(1，2，3，4，5 mL)對發酵米糠真蛋白含量的影響。

(3) 發酵時間：在發酵溫度28 ℃，接種量1 mL，裝料量10 g，初始pH 5.5，初始水分含量50%的條件下，考察發酵時間(48，72，96，120，144 h)對發酵米糠真蛋白含量的影響。

(4) 裝料量：在發酵溫度28 ℃，接種量1 mL，發酵時間96 h，初始pH 5.5，初始水分含量50%的條件下，考察裝料量(10，15，20 g)對發酵米糠真蛋白含量的影響。

(5) 初始pH：在發酵溫度28 ℃，接種量1 mL，發酵時間96 h，裝料量10 g，初始水分含量50%的條件下，考察初始pH(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0)對發酵米糠真蛋白含量的影響。

(6) 初始水分含量：在發酵溫度28 ℃，接種量1 mL，發酵時間96 h，裝料量10 g，初始pH 5.5的條件下，考察初始水分含量 (40，50，60，70，80%)對發酵米糠真蛋白含量的影響。

1.3.6 Plackett-Burman試驗設計 在單因素結果分析的基礎上，利用Design-Expert.8.0.5軟件，設計Plackett-Burman(PB)試驗，以初始pH、裝料量、初始水分含量、時間、溫度和接種量為影響因素，設置高低兩個水平，高水平為低水平的1.25倍。以發酵米糠中真蛋白含量為響應值，根據各因素的顯著性，篩選出最主要的因素進行固態發酵條件的響應面優化試驗。

1.3.7 響應面試驗設計 由PB試驗優化得到的3個最顯著的因素(溫度、時間、初始水分含量)設計響應面試驗，利用Design-Expert.8.0.5軟件進行Box-Behnken中心組合試驗設計。得到二次回歸方程，確定最佳固態發酵條件組合。

1.3.8 驗證實驗和數據分析 根據二次回歸方程得出的最佳發酵條件組合，設計驗證實驗。以上試驗均做3組平行。PB試驗和Box-Behnken中心組合試驗數據分析及處理由Design-Expert.8.0.5軟件和SPASS軟件輔助完成。

2 結果與分析

2.1 固態發酵對米糠成分的影響

2.1.1 固態發酵對米糠中真蛋白含量的影響 由圖1可知，真蛋白含量在發酵72 h時達到最大值，之后隨著發酵時間的延長逐漸降低。發酵過程中真蛋白含量的增加主要由外加氮源的加入和蛋白質“濃縮效應”[17]共同完成。外加氮源的加入使得黑曲霉利用無機氮源合成自身的菌體蛋白，提高了發酵米糠的真蛋白含量。與此同時，在發酵過程中黑曲霉的生長呼吸作用，產生了二氧化碳和水，使得發酵產物的質量減少，出現了蛋白質的“濃縮效應”。

發酵前期，菌體生長代謝活動較旺盛，利用基質中無機氮源和有機氮源進行自身菌體蛋白的合成，蛋白含量增加。此時基質中菌體的蛋白合成能力大于蛋白分解能力。發酵后期，菌體進入衰亡期，此時菌體的蛋白分解能力大于蛋白合成能力，所以蛋白含量會有所下降，此時蛋白含量的下降可能是真菌對蛋白分解作用和基質“濃縮作用”共同完成。Silveira等[18]利用根霉固態發酵脫脂米糠，粗蛋白含量提高了69%。Schmidt等[15]利用米根霉半固態發酵米糠，粗蛋白含量較未發酵米糠提高了53%。總之，固態發酵對真蛋白含量有積極的影響。

2.1.2 固態發酵對米糠中脂肪和灰分含量的影響 由圖2可知，米糠未發酵之前的脂肪含量為16.91%，脂肪含量隨著發酵時間的延長逐漸降低，經過96 h的固態發酵之后，脂肪含量降到11.48%，固態發酵過程中脂肪含量的降低可能是由于脂肪被真菌利用，用來合成自身的生物膜系統中的磷脂[19]。Larine等[20]利用米根霉固態發酵米糠120 h，脂肪含量從15.2%降至7.4%，降低了51.32%，差異顯著(P<0.05)。固態發酵可以降低米糠中的脂肪含量，而米糠的酸敗問題主要是脂肪酶分解脂肪造成的。所以，固態發酵可以作為一種潛在的米糠保存方式。

由圖2還可知，灰分含量隨發酵時間的延長逐漸增加。發酵120 h后測定發酵米糠中灰分含量，其含量從原來的7.01%增加到8.91%，增加了27.10%。主要是由于黑曲霉利用米糠中的營養物質進行生長代謝，真菌生物量增加，米糠中大分子物質被菌體利用分解，基質中小分子物質增加，無機物增多。Larine等[20]利用米根霉固態發酵米糠120 h時，灰分含量從9.4%增加到13.9%，增加了47.87%，表現出顯著性差異(P<0.05)。與本研究結果趨勢一致。

2.1.3 固態發酵對米糠中總糖含量的影響 由圖3可知，發酵過程中總糖含量持續下降，發酵96 h后，米糠中的總糖含量從342.33 mg/g降至221.67 mg/g，降低了35.25%，差異顯著(P<0.05)。表明基質中的糖類被菌體利用，分解產生能量和小分子物質供菌體進行生長代謝活動。發酵初期，菌體生長較快，在菌體生長過程中產生的纖維素酶、淀粉酶等對多糖的降解作用，導致總糖含量下降較快。發酵后期基質已不再適合菌體生長，菌體分解利用糖類變慢，總糖含量下降速度減緩。

2.2 響應面優化試驗結果與分析

2.2.1 Plackett-Burman試驗設計及結果分析 以真蛋白含量為響應值，設計米糠固態發酵條件的響應面優化試驗。由單因素試驗結果分析得出Plackett-Burman(PB)試驗設計方案見表1，對初始pH、裝料量、初始水分含量、時間、溫度和接種量進行顯著性分析，設置高水平為低水平的1.25倍。利用Design-Expert.8.0.5軟件輔助分析PB試驗結果。由表2可知，6個因素對固態發酵米糠中真蛋白含量的影響順序為：溫度>時間>初始水分含量>裝料量=接種量>初始pH。根據ANOVA分析，得出該模型顯著(P=0.003 6<0.05)，R2=0.952 6，說明該模型有95.26%的數據可信。

2.2.2 響應面設計試驗結果及分析 由PB試驗得出的影響固態發酵米糠中真蛋白含量的3個顯著性因素，利用Design-Expert.8.0.5軟件進行Box-Behnken的中心組合試驗設計，以溫度、時間和初始水分含量為因素，設計三因素三水平的試驗方案，設計方案見表3、4。試驗結果分析由Design-Expert.8.0.5軟件輔助完成。

根據響應面ANOVA結果分析得到因素A、B、C的二次回歸方程：

Y=19.7-0.14A+0.69B-0.53C+0.29AB-0.82AC+0.7BC-0.53A2-1.05B2-1.3C2。

(1)

由表5可知，P=0.000 9<0.01，表明模型以真蛋白含量為響應值時，該模型極顯著。失擬項P=0.191 4>0.1，表明試驗結果和模型方程擬合良好。相關系數R2=0.949 4，表明有94.94%的數據可以由模型方程解釋。CV越小，說明模型置信度越好。該模型變異系數CV=2.4%，說明模型方程能夠較好地反映真實的試驗值。校正決定系數為0.884 4，說明該模型可以解釋88.44%的數據變異。綜上所述，該模型為固態發酵條件提供了一個很好的選擇。

? 同一列數據不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

?R2=0.952 6。

由回歸方程得到的固態發酵最佳條件：溫度37.18 ℃，時間102.86 h，初始水分含量58.52%，得到真蛋白含量為19.83%，比原米糠蛋白含量提高了43.17%。驗證實驗選擇條件發酵時間37 ℃，時間102 h，初始水分含量60%，接種量20 mL/100 g米糠，初始pH 5.5，裝料量150 g，固態發酵在托盤中進行，得到發酵米糠的真蛋白含量為19.65%。比原米糠蛋白含量提高了41.88%。試驗結果與預測試驗結果相差不大，說明固態發酵優化工藝有效。

? 同一列數據不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 發酵米糠中17種常規水解氨基酸含量的變化

考慮到發酵米糠的適口性、外觀性以及發酵成本等因素，根據實際情況選擇縮短發酵時間，降低發酵溫度來抑制孢子的形成并降低能耗，最終選擇發酵溫度34 ℃，發酵時間72 h，初始水分含量60%，初始pH 5.5，接種量20 mL/100 g米糠，得到的真蛋白含量為18.15%，較原米糠提高了31.05%。此條件下發酵米糠中黑曲霉孢子得到很好的抑制，發酵成本降低，品質達到很好的改善。在此條件下測定氨基酸含量的變化。

?R2=0.949 4，AdjR2=0.884 4，CV=2.40%，Adeq Precision=12.647。

由表6可知，發酵過程中氨基酸含量在不斷增加，原米糠中氨基酸含量為11.76%，發酵72 h后氨基酸總量達到15.22%，較原米糠增加了29.42%，差異顯著(P<0.05)。蛋白質的營養價值取決于氨基酸種類和含量，其中必需氨基酸的含量是評價蛋白質質量的一個重要指標。發酵72 h時，限制性氨基酸蛋氨酸、蘇氨酸占總氨基酸含量顯著增加(P<0.05)，分別增加了73.92%和22.99%。發酵96 h時，總氨基酸含量略有下降，主要是基質中大部分營養物質被利用，此時發酵體系中菌體對蛋白的分解能力大于蛋白合成能力。總的來說，固態發酵能夠有效改善氨基酸組成，使必需氨基酸和限制性氨基酸較發酵前都有所提高。因此，固態發酵對米糠中的氨基酸組成起到了很好的改善作用。

3 結論

(1) 固態發酵對米糠成分的改善有一定作用。在一定的發酵時間內，蛋白和灰分含量隨著發酵時間的延長逐漸增加，脂肪和總糖含量則逐漸降低。這為今后米糠在固態發酵方面的應用和發展提供了一定的理論基礎。

? 同一行數據不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

(2) 固態發酵過程中真蛋白的富集優化試驗表明，最佳發酵條件為：溫度37 ℃，時間102 h，初始水分含量60%，初始pH 5.5，接種量20 mL/100 g米糠，此時發酵米糠的真蛋白含量19.65%，比原米糠提高了41.88%。因此，固態發酵米糠可以作為一種生產高蛋白發酵產品的潛在方式。

(3) 固態發酵過程中富集真蛋白的來源和性質還需進一步進行研究和分析。

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Effect of solid-state fermentation on the ingredients of rice bran

YIN Xiao-chaoQIANHai-fengWANGLiZHANGHuiQIXi-guang

(SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

In this paper, the changes of protein, lipid, ash and total sugar of rice bran after solid-state fermentation were studied for deep development of rice bran resources. The results showed that the contents of protein and ash increased significantly after fermentation. Moreover, the contents of lipid and total sugar decreased gradually with fermentation time. The optimized fermentation condition was: 37 ℃, 102 h, moisture content of 60%, initial pH 5.5, inoculation amount of 20 mL/100 g, with the true protein content as the response value. In this condition，the true protein content of fermented rice bran was 19.65%,increased 41.88% compared with the raw rice bran. In addition, the results of amino acid analysis showed that the contents of methionine and threonine were increased by 73.92% and 22.99% respectively compared with the original rice bran.

Solid-state fermentation; Rice bran;Aspergillusniger

十二五863計劃(編號：2013AA102203-07)

尹孝超，男，江南大學在讀碩士研究生。

錢海峰(1973—)，男，江南大學副教授，博士。 E-mail: qianhaifeng@jiangnan.edu.cn

2017-01-04

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.009