基于雙指標分析法和聚類分析法的花椒紅外指紋圖譜研究

課凈璇 黎杉珊 申光輝 吳賀軍 羅擎英 劉興艷 陳安均 張志清

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

基于雙指標分析法和聚類分析法的花椒紅外指紋圖譜研究

課凈璇 黎杉珊 申光輝 吳賀軍 羅擎英 劉興艷 陳安均 張志清

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

為探索建立一種有效鑒別花椒產地的方法，以17份不同產地花椒為原料，采用傅里葉變換紅外光譜技術結合雙指標分析法和聚類分析法研究不同產地花椒之間親緣遠近關系，并對花椒紅外二階導數光譜圖進行分析比較，研究花椒所含特征物質與產地之間的關系。結果表明，不同產地花椒紅外光譜圖頻率分布基本一致，但在3 500～2 800 cm-1和1 700～1 000 cm-1兩個波段中吸收峰數目和強度存在差異；應用雙指標分析法可精確地表示樣品間的親緣關系；紅外圖譜經二階導數處理，將特征峰峰高值導入SPSS 22.0 軟件進行聚類分析，17個花椒樣品被分為五類。試驗探索出了一種簡便、有效的花椒產地鑒別方法。

花椒；紅外光譜；雙指標分析法；聚類分析法

花椒為蕓香科植物青花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. et Zucc.)或花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的干燥成熟果皮[1]。全球有200余種[2]，中國現有50余種，主要品種有竹葉花椒、青花椒、花椒、川陜花椒和野花椒等[3]。四川、陜西、云南、西藏、貴州、廣東和廣西等地區是花椒的主要產地[4]。研究表明，花椒中含有豐富的揮發油[5]、酰胺類[6]、酮類[7]、酚類[8]等有效成分。但不同產地的花椒在化學成分上有較大的差別，造成不同品種的花椒在品質和風味上存在差異[9]。目前，市場上花椒品種繁多，且其加工制品品質差別較大，在生產或應用中常會出現品種不一的情況，使得花椒在深加工及應用領域(如醫學)受到一定程度的限制。

化學指紋圖譜技術可以對原料產地進行溯源，判斷原料及其半成品和成品品質的均一性[10]，它強調的是化學譜圖的“完整面貌”即整體性，反映的質量信息是綜合的，可以整體地評價樣品質量[11]。指紋圖譜技術與雙指標序列分析法和聚類分析法結合可以分析樣品之間的親疏遠近關系，對樣品進行分類[12]。化學指紋圖譜技術最初主要應用于中藥地道藥材的產地溯源，即中藥指紋圖譜技術。花椒作為藥食同源性食物亦可用化學指紋圖譜技術來評價其質量和產地鑒定。張玖等[13]采用水蒸氣蒸餾—乙醚萃方法提取花椒揮發油，建立了基于揮發油的花椒氣相色譜指紋圖譜，并利用氣相色譜—質譜聯用技術(GC—MS)確定了特征峰物質為β-月桂烯。杜文倩等[14]采用高效液相色譜法測定花椒乙醇提取物，建立了基于花椒麻味物質的HPLC指紋圖譜，并通過液質聯用的方法定性分析共有峰，為紅花椒產地溯源提供理論依據。

紅外光譜技術具有綠色、無損和操作簡便等特點[15]。紅外光譜技術較多應用于中藥鑒別和質量評價中[16-17]。目前，該技術也廣泛應用于食品行業中[18]。單明秋等[19]采用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)技術，對不同產地的側柏葉進行紅外光譜分析，并結合雙指標序列分析法計算不同產地側柏葉的相似性，得出結論為產地相同或相近的側柏葉樣品具有較高的共有峰率。齊海燕等[20]應用紅外光譜技術并結合聚類分析法，測定不同產地花椒，從樣品特征吸收峰的差異性將12批樣品分為4類，分類情況與實際情況相符，說明紅外光譜技術可用于花椒的品質測定。目前，已有較多研究學者應用近紅外光譜技術定量檢測花椒中某種化學成分的含量，如吉卉[21]42-48研究了基于近紅外光譜技術花椒蛋白質含量的快速測定；王剛等[22]研究了花椒揮發油含量的近紅外光譜無損檢測；李洋等[23]應用近紅外光譜技術研究了花椒生物堿和揮發油含量的無損檢測。而花椒紅外光譜指紋圖譜的研究較少。吉卉[21]18-31采用多類逐步判別分析和BP神經網絡兩種模式識別方法建立了同一品種不同產地花椒的鑒別模型，研究了花椒品質指標與紅外光譜圖之間的內在聯系，但模型建立過程較為繁瑣。根據齊海燕等[20]研究，在分析花椒紅外光譜時只用了聚類分析法對樣品進行分類，分類結果明顯，但不能具體地表現各樣品之間的相似度。本研究擬采用傅里葉變換紅外光譜技術測定17批不同產地花椒的紅外光譜，并且采用雙指標序列分析法結合聚類分析法分析花椒樣品紅外光譜，其中雙指標序列分析法可精確地表示出不同產地花椒之間的相似度。又通過比較不同產地花椒紅外二階導數圖譜的差異性，分析不同產地花椒所含化學物質的差異性，旨在建立一種直觀、快速和有效的花椒產地鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

共計17個花椒樣品(見表1)。所有的花椒樣品在45 ℃下干燥24 h，經高速粉碎機粉碎后，取0.5 g研磨過200目篩，儲存備用；

KBr：光譜純，北京百靈威科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

傅里葉變換紅外光譜儀：FT-IR NICOLET is10型，賽默飛世爾科技有限公司；

壓片機：YP-2型，上海山岳科學儀器有限公司；

分析天平：Sartorius CPA225D型，德國賽多利斯股份公司；

高速萬能粉碎機：FW-100型，北京中興偉業儀器有限公司。

1.2 試驗方法

花椒紅外光譜測定：精確稱取花椒樣品0.010 0 g和0.990 0 g KBr混合研磨均勻后，取0.1 g花椒與KBr混合物壓制成厚薄均勻的透明樣品片。壓片條件為：壓力20 kPa，時間3 min。儀器分辨率為4 cm-1，掃描范4 000～400 cm-1，空氣作為背景，掃描32次，每個樣品平行測定3次。所有測定光譜圖均扣除空氣背景光譜。

1.3 紅外分析的方法學考察

1.3.1 精密度試驗 取同一份花椒樣品片(本研究中所取的花椒樣品為1號樣品，即Z1韓城大紅袍)連續測定6次，計算光譜圖透過率和共有峰波數的RSD值，考察儀器精密度。

1.3.2 穩定性試驗 取同一份儲存的花椒樣品(Z1韓城大紅袍)按1.2方法制樣，每2 h測定一次，共測定6次，計算光譜圖透過率和共有峰波數的RSD值，考察方法穩定性。

1.3.3 重現性試驗 取同一份花椒樣品(Z1韓城大紅袍)，按1.2方法平行制備6份樣品片，分別測定其光譜圖。計算光譜圖透過率和共有峰波數的RSD值，考察方法重現性。

1.4 數據處理

1.4.1 花椒紅外二階導數光譜圖分析 紅外光譜經二階導數處理后可提高其分辨率，本試驗采用Savitsky-Golay導數33點波數3進行二階導數處理，得到特征峰突出，噪音小的二階導數光譜圖[21]18-20。且根據花椒紅外二階導數光譜圖出峰數目、峰形狀和強度的差異判斷不同產地花椒所含特征物質的種類和含量。其中出峰位置可以對花椒中所含特征成分進行定性分析，峰強度表示花椒所含特征物質的含量。根據花椒紅外光譜圖中主要出峰位置，對花椒紅外二階導數光譜圖中3 000～2 500 cm-1和1 800～1 000 cm-1兩個波段出現的特征峰的峰高進行計算和比較分析。

1.4.2 花椒紅外光譜雙指標序列分析 雙指標序列分析法可以同時表示樣本中兩兩樣品間的相似性和差異性，樣品之間的相似性用共有峰率表示，樣品之間的差異性用變異峰率表示[19]。相關公式如下[24-25]：

(1) 共性指標：

共有峰率P：P=(Ng/Nd)×100%；

(1)

共有峰數Ng：指在比較的兩張紅外指紋圖譜中都出現的吸收峰的總數；

獨立峰：在對比的兩張紅外指紋圖譜中不同的吸收峰，na(b)為紅外指紋圖譜a(b)中相對于其共有峰的非共有峰的峰數，稱為a(b)的變異峰數；

獨立峰數Nd：指在比較的兩張紅外指紋圖譜中的獨立峰的總數，Nd=Ng+na+nb。

(2)

(2) 變異性指標：

變異峰率Pv：指在該紅外指紋圖譜中變異峰數與其共有峰數的比值；

紅外指紋圖譜a(b)的變異峰率Pva(b)：Pva(b)=[na(b)/Ng]×100%。

(3)

1.4.3 聚類分析 對花椒紅外二階導數光譜圖中3 000～2 500 cm-1和1 800～1 000 cm-1兩個波段出現的特征峰的峰高進行計算，將得到的數據導入SPSS 22.0。利用組間連接法，歐氏距離的平方(Squared Euclidean Distance)為測度，對17個產地的花椒樣品紅外光譜相似性進行系統聚類分析。

2 結果與討論

2.1 紅外分析的方法學考察

精密度試驗結果表明，按1.2的試驗方法測定6次所得的光譜圖透過率和共有峰波數的RSD值分別小于0.87%，0.06%。穩定性試驗結果表明，按1.2的試驗方法測定6次所得的光譜圖透過率和共有峰波數的RSD值分別小于0.81%，0.21%。重現性試驗結果表明，按照1.2方法測定6次所得的光譜圖透過率和共有峰波數的RSD值分別小于2.05%，0.09%。

綜上可知，花椒紅外光譜圖基本一致，且在精密度試驗、穩定性試驗和重現性試驗中計算出RSD值均小于3%，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》(暫行)中的規定[26]。

2.2 花椒紅外光譜分析

按照1.2的試驗方法測定17個花椒樣品的紅外光譜，并利用OMNI軟件求出每種花椒的平均譜圖。對求出的平均圖譜進行自動基線校正、自動平滑、縱坐標歸一化等預處理。

由圖1中a曲線可知，花椒紅外光譜主要分為2個波段：3 500～2 800 cm-1和1 700～1 000 cm-1。對絕對峰值大于80%的峰標峰位，可以看出花椒的紅外光譜圖具有17個明顯的吸收峰，其中在第一波段主要峰位置為3 408.1，3 363.0，2 956.3，2 925.8，2 854.0 cm-1。3 408.1 cm-1附近寬強峰為蛋白質N—O伸縮振動、水分子中O—H收縮振動引起的吸收峰；3 375.0 cm-1附近為羥基O—H收縮振動峰；2 956.3 cm-1附近的吸收峰是甲基—CH3的伸縮振動引起的；2 925.8 cm-1和2 854.0 cm-1附近分別是亞甲基的順式及反式伸縮振動引起的吸收峰[27]。第二波段中主要的出峰位置為1 738.1，1 651.3，1 628.3，1 515.5，1 441.6，1 384.6，1 319.3，1 254.9，1 156.2，1 103.7，1 060.0，1 022.6 cm-1。1 738.1 cm-1附近是醛類物質中羰基C═O伸縮振動引起的吸收峰；1 651.3 cm-1附近為酮的C═C吸收峰[28]；1 628.3 cm-1和1 515.5 cm-1附近分別為酰胺Ⅰ帶，酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰[18]；1 441.6，1 384.6，1 103.7～1 022.6 cm-1為C—H鍵彎曲振動引起的吸收峰[29]，再根據特征區3 375.0 cm-1的吸收峰基本上可判斷1 103.7～1 022.6 cm-1為酚類物質的吸收峰；1 319.3 cm-1和1 254.9 cm-1附近為羧酸酯類的C—O—C特征吸收峰。1 156.2 cm-1附近為酸酐的振動吸收峰[30]。紅外光譜能從整體上反應出花椒含有化學成分的復雜性，即使不同產地花椒樣品的紅外光譜圖大體一致，但是個別特征峰的出峰數目和強度會有所不同。直觀地從圖譜上得到的信息是有限的，需要對圖譜進行二階導數處理或其他方法結合以獲得更多的信息。

a. 紅外光譜(對應左側縱坐標軸) b. 紅外二階導數光譜(對應右側縱坐標軸)

圖1 5號花椒紅外光譜圖與紅外二階導數光譜圖

Figure 1 The infrared fingerprints and the second derivative of the infrared fingerprints of No.5Z.bungeanumMaxim.

2.3 不同產地花椒紅外二階導數光譜圖比較

紅外光譜圖經二階導數處理后，峰寬變為原圖譜峰寬的1/3，使重疊在一起的峰相互分開，可以更準確地指認峰位，提高圖譜的分辨率[31]。在本試驗中，各花椒樣品的平均圖譜經預處理后，采用Savitsky-Golay導數33點波數3進行二階導數處理，得到特征峰突出、噪音小的二階導數光譜圖。花椒紅外二階導數光譜圖可使不同特征物質吸收峰的差異性更顯著，將不同產地和品種花椒紅外光譜的區別進一步放大。花椒紅外光譜圖經處理后得到花椒紅外二階導數光譜圖見圖1中b曲線。17個花椒樣品紅外二階導數光譜圖分析結果：1 738 cm-1的吸收峰為醛類物質的C═O的吸收峰，Z15(四川漢源)在此處的吸收峰強度最大，達到0.000 81，其次是Z7(四川九龍)、Z8(甘肅武都)、Z13(甘肅武都)和Z16(四川三臺)，峰強度最小的是Z14(四川金陽)，峰強度為0.000 25，表明不同產地花椒醛類物質的含量有所不同；1 651 cm-1處的吸收峰強度較大，可判斷為是酮類物質的吸收峰[32]，其中Z8(甘肅武都)的峰強度最大，峰高為0.001 91，其次是Z12(云南紹通)、Z16(四川三臺)、Z5(四川漢源)、Z6(四川漢源)和Z2(陜西鳳縣)，峰強度最低的是Z1(陜西韓城)峰強度為0.000 73，說明甘肅、云南、和四川地區花椒中含有的酮類物質較多，陜西地區花椒中所含酮類物質較少；1 628～1 515 cm-1的吸收峰為酰胺類物質的吸收峰，可反映樣品中蛋白質含量。Z16(四川三臺)在此處的峰高最高分別為0.000 72和0.001 03，其次是Z17(四川三臺)、Z6(四川漢源)和Z14(四川金陽)，峰高最低的是Z8、Z9和Z10，這3個樣品都是來自甘肅武都，由此可看出四川地區花椒蛋白質含量較多，產地為甘肅的花椒樣品中蛋白質含量較少。該結果表明花椒蛋白質的含量與地域之間有較強的聯系；1 103～1 022 cm-1處的3個吸收峰對應的是酚類物質的吸收峰，花椒提取物的抗氧化活性與花椒中含有酚類物質密切相關。花椒樣品在此處的吸收峰較強，這與趙晨等[33]研究結果中花椒提取物具有一定的抗氧化活性相一致。其中Z1此處的吸收峰峰高為0.001 19，0.001 40，0.001 22，其次是Z2，其峰高為0.001 20，0.001 03，0.000 85，這兩個樣品的產地都是陜西。產自四川三臺的Z16和Z17在此處的吸收峰的峰高也比較高，且峰高相近。產地為四川茂縣的Z3在此處的吸收峰強度較小，分別為0.000 74，0.000 45，0.000 53。根據此結果可以判斷出陜西韓城大紅袍和陜西鳳縣大紅袍所含多酚類物質較多，該試驗結果與張艷軍[34]采用福林-酚比色法測定不同品種花椒多酚含量得出的相似。以上結果表明花椒所含特征成分的類型和含量與產地有較大的關系，受產地氣候、土壤和當季降水量等的影響較大[35]16-33。花椒所含特征成分的類型與含量的不同會影響花椒的性質與應用。如研究花椒提取物的抗氧化活性或是在醫藥中研究可以選擇酮類或者酚類物質含量較多的花椒品種，或者選擇適當產地的花椒樣品。

2.4 不同產地花椒紅外光譜共有峰率、變異峰率分析

共有峰是指該組內吸收峰波數差值的最大值明顯小于該組吸收峰與其相鄰吸收峰波數之差平均值的一吸收峰[36]。如2 925.8 cm-1對應的一組峰，其平均波數為2 922.8 cm-1，組內波數差最大值為9.0 cm-1，相鄰的前后兩組峰的波數差平均值分別為30.5 cm-1和71.8 cm-1，明顯大于9.0 cm-1，故可認為2 925.8 cm-1對應的一組為一組共有峰。

按1.4.2的方法對17批不同產地花椒的共有峰率和變異峰率進行雙指標序列分析，結果表明17個材料可分為3組，即A組(表2)、B組(表3)和C組(表4)，具體見表2～4。

由以上序列可知，在表2中即Z1～Z11號樣品為紅花椒和大紅袍，其共有峰率最大為100%，最小為74.6%，變異峰率最大為12.5%，最小為0，整體的相似度較高。共有峰率最高的是Z8:Z10，高達100%，Z8和Z10都是產自甘肅省的武都大紅袍，相同的產地，花椒的性質也幾乎相同，其相似度如此之高也是符合實際情況的。共有峰率最低的是Z1:Z5和Z1:Z7都是74.6%，Z1是產于陜西韓城的大紅袍，Z5是產于四川越西，Z7是產于四川省九龍縣的紅花椒。Z1與Z5和Z7之間產地的地域差異較大造成共有峰率偏低，不同產地對于紅花椒所含化學成分有一定的影響。

在表3中樣品編號為Z12～Z17，都是青花椒品種，共有峰率在70.5%～93.3%，變異峰率在0～17.4%，整體的相似度較低。共有峰率最高的是Z14:Z17和Z16:Z17，共有峰率都是93.3%，Z17相對于Z14和Z16具有相同的變異峰率，為6.7%。Z14、Z16和Z17都是產自四川省的青花椒，其中Z16和Z17的產地都是四川三臺，但是收獲時期不同，說明青花椒所含化學成分的種類和收獲時期有一定關系，受氣候影響較大。縱觀A組與B組數據，可以看出紅花椒之間的共有峰率在整體上要高于青花椒之間的共有峰率，青花椒之間的變異峰率要高于紅花椒之間的變異峰率，氣候、土壤等條件對青花椒所含的化學物質影響較大，說明青花椒品質受產地的影響大于紅花椒[37]。

表4是紅花椒與青花椒之間的對比，共有峰率最大為87.5%，最小為63.1%，變異峰率最大為17.6%。不同產地紅花椒與青花椒之間的相似性小于87.5%，則表明紅花椒與青花椒所含化學物質有較大的差異，說明不同種花椒品質之間相差較大，這與宋麗等[38]采用HPLC法得出的紅花椒與青花椒品質相差較大結果一致，且該紅外光譜技術操作較簡單，無污染。

2.5 聚類分析

系統聚類可以根據樣品之間的親疏遠近關系將樣品分類，較適合樣品數量較少時的聚類分析，最終輸出樹狀圖的聚類結果[39]。本試驗聚類分析結果表明，17批花椒樣品被分為5大類，花椒樣品的紅外光譜聚類分析樹狀圖見圖2。其中第Ⅰ類為Z14、Z16和Z17，分別是來四川的三臺和金陽，品種為青花椒；第Ⅱ類是Z13，其產地是甘肅武都，為青花椒；第Ⅲ類是Z5、Z8、Z4、Z7、Z3、Z9、Z6、Z10、Z11、Z2和Z1，該類是紅花椒，其中Z1和Z2的距離最近，其產地都是陜西；第Ⅳ類是Z15，其產地是四川漢源，品種為青花椒，根據花椒紅外二階導數圖譜分析，Z15在1 738 cm-1處的吸收峰最大，此處為醛類物質的吸收峰，花椒揮發油中含有較多的醛類物質，所以Z15被單獨聚類；第Ⅴ類是Z12，來自云南昭通，品種為青花椒。以上結果表明，不同產地的花椒所含化學成分具有一定的差異性。在本研究中不同地區的青花椒所含化學成分差異性較大。如Z12～Z17都是青花椒，但是因產地相差大，而被系統分為不同類別，說明產地和環境因素對品質的影響青花椒大于紅花椒，該結論與余曉琴[35]106-115對花椒HPLC指紋圖進行聚類分析得到的結果一致。

3 結論

花椒藥食同源，含有復雜的化學物質，其所含特征物質的類型和含量受土壤條件、氣候變化等環境因素的影響，其中產地是影響花椒品質最主要的因素之一，具有較明顯的本草學特點。紅外光譜可以綜合地反應不同產地或品種花椒之間化學成分的差異性和多樣性。經過對花椒紅外二階導數光譜圖的分析可比較出花椒中主要特征物質含量的情況，由分析結果可以清楚地看出花椒中醛類、酮類、酚類和蛋白質的含量受產地的影響較大。通過共有峰率、變異峰率雙指標序列法可清楚地得知兩種花椒之間的相似性。通過系統聚類分析可直觀地看出不同產地花椒的分類情況，且分類情況與實際情況相符。故采用紅外光譜技術結合共有峰率、變異峰率雙指標分析法和聚類分析法等分析方法可快速、有效地對花椒進行產地鑒別。另外，本研究只對中國西部地區所產花椒進行測定和分析比較，其他產地的花椒尚未涉及，且本研究采用紅外光譜技術對花椒中所含化學物質進行了初步的定性測定，具體化學物質的定量測定還需深入研究。

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Infrared Fingerprint Analysis of Zanthoxylum Based on Sequential Dual-Indexes and Cluster Analysis Method

KE Jing-xuanLIShan-shanSHENGuang-huiWUHe-junLUOQing-yingLIUXing-yanCHENAn-junZHANGZhi-qing

(CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China)

It was focused on setting a effective way for tracing the producing area ofZanthoxylumin this study, by using infrared fingerprints. The methods of dual-indexes and cluster had been applied to analyze the infrared fingerprints so as to investigate similarity of 17 samples. Moreover, the relationship between the producing area and prime substances inZ.bungeanumMaxim. has been researched by analyzing second derivative of the infrared fingerprints ofZ.bungeanumMaxim. The infrared spectras ofZanthoxylumhad the similar characteristic peaks, but there were still some differences in the number and intensity of the absorption peaks in the range of fingerprint region 3 500～2 800 cm-1and 1 700～1 000 cm-1. The degree of similarity of 17 samples were accurate when used sequential analysis of dual-indexes. The peak heights of infrared fingerprints after reckoned second derivative were used to cluster analysis by SPSS 22.0, and 17 samples were divided into five categories, obviously. In this study, a simple and convenient method for identification ofZanthoxylumwas explored.

Zanthoxylum.; Infrared spectrum; Dual-Indexes sequential analysis; Cluster analysis

四川省科技廳應用基礎項目 (編號: 2016JY0118)；國家林業局林業行業標準項目 (編號: 2015-LY-184)

課凈璇，女，四川農業大學在讀碩士研究生。

張志清(1976—)，男，四川農業大學教授，博士生導師，博士。E-mail: zqzhang721@163.com

2017-01-16

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.012