牛至精油-白藜蘆醇乳液的制備及抑菌活性研究

李群英廖紅梅 方 正,2 梁 麗,2

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

牛至精油-白藜蘆醇乳液的制備及抑菌活性研究

李群英1廖紅梅1方 正1,2梁 麗1,2

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

基于牛至精油具有較強(qiáng)的刺激性氣味、白藜蘆醇溶解性低，以及二者穩(wěn)定性差的應(yīng)用缺陷，構(gòu)建以酪蛋白酸鈉為乳化劑，菊粉和阿拉伯膠為穩(wěn)定劑，牛至精油為油相并包埋白藜蘆醇的乳液；以鼠傷寒沙門氏菌為目標(biāo)微生物，探討牛至精油、白藜蘆醇、牛至精油-白藜蘆醇及其乳液的抑菌效果，以及 4，25 ℃ 儲(chǔ)藏期間抑菌效果的變化，并在鮮切卷心菜中初步應(yīng)用。結(jié)果表明：牛至精油和白藜蘆醇對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有很好的協(xié)同抑菌作用；2.0% 菊粉/阿拉伯膠可以提高牛至精油-白藜蘆醇的抑菌效果；乳液可降低二者的氧化降解速率并保護(hù)其生物活性，乳液 4 ℃ 貯藏 20 d，25 ℃ 貯藏 12 d 后仍有較好的抑制作用。接種鼠傷寒沙門氏菌的鮮切卷心菜在牛至精油-白藜蘆醇及其酪蛋白酸鈉、酪蛋白酸鈉-菊粉/阿拉伯膠乳液中處理 1 min，8 ℃ 儲(chǔ)藏 4 d 后菌落數(shù)分別降低了 1.52，2.04，2.67，2.98 lg CFU/g。

牛至精油；白藜蘆醇；包埋；抑菌作用；鼠傷寒沙門氏菌

動(dòng)物源和植物源食品如雞蛋、番茄沙拉和甜瓜容易感染沙門氏菌，這不僅會(huì)破壞食品的感官品質(zhì)，更危害人類健康甚至導(dǎo)致死亡[1-2]。越來越多的消費(fèi)者更加關(guān)注食品安全及其感官品質(zhì)，安全有效的天然抑菌劑如精油和植物提取物成為一種新選擇[3-4]。

牛至精油是牛至全草的莖和葉的提取物，主要由香芹酚、百里香酚和其它揮發(fā)性成分組成。香芹酚和百里香酚能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物流出，因此具有很強(qiáng)的抗菌活性[5-6]。Virginia Muriel-Galet 等[7]研究發(fā)現(xiàn)牛至精油能很好地抑制大腸桿菌(抑菌圈直徑 4.41 cm)，30 ℃ 貯藏 12 d 后對(duì)擴(kuò)展青霉仍有很強(qiáng)的抑制作用。白藜蘆醇是一種多酚化合物，能與過渡金屬銅反應(yīng)生成氫過氧化合物破壞細(xì)胞內(nèi)大分子(如 DNA、蛋白質(zhì)、ATP 酶和細(xì)胞膜)，從而導(dǎo)致微生物死亡[8-9]。然而，基于牛至精油較強(qiáng)的刺激性氣味、白藜蘆醇的低溶解性，以及二者穩(wěn)定性差的應(yīng)用缺陷，因此解決這些問題成為食品應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一。包埋可以掩蓋精油氣味對(duì)食品品質(zhì)的影響，提高白藜蘆醇的溶解度，保護(hù)生物活性并達(dá)到緩釋效果。此外，多種天然抑菌劑復(fù)配使用，如乳酸鏈球菌素、殼聚糖或其它植物精油與低濃度的牛至精油復(fù)配，不僅可達(dá)到高濃度精油相同的抑菌效果，表現(xiàn)出協(xié)同抑菌作用；還能降低高濃度精油對(duì)食品感官的影響[3,7]。

本試驗(yàn)擬構(gòu)建以酪蛋白酸鈉為乳化劑、菊粉和阿拉伯膠為穩(wěn)定劑、牛至精油為油相并包埋白藜蘆醇的乳液體系；以鼠傷寒沙門氏菌為目標(biāo)微生物，探討牛至精油、白藜蘆醇、牛至精油和白藜蘆醇及其乳液對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果，以及 4 ℃ 和 25 ℃ 貯藏期間抑菌效果的變化，并在鮮切卷心菜中初步應(yīng)用，旨在為牛至精油協(xié)同白藜蘆醇乳液應(yīng)用于鼠傷寒沙門氏菌的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酪蛋白酸鈉(sodium caseinate，SC，生化試劑)、阿拉伯膠(gum Arabic，GA，食品級(jí))、牛至精油(OEO，F(xiàn)CC 級(jí))、虎杖苷(色譜純)：美國 Sigma-Aldrich 公司；

菊粉(Inulin)：食品藥品級(jí)，山西帕尼爾生物科技有限公司；

白藜蘆醇(resveratrol)：生化試劑，上海生工生物工程有限公司；

蛋白胨、牛肉膏：分析純，北京奧博星生物科技有限公司；

酵母粉、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂粉、乙醇：分析純，國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 菌株與培養(yǎng)基

鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)CMCC 50115：中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心；

BPY液體培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g/L；酵母浸出粉 5 g/L；葡萄糖 5 g/L； NaCl 5 g/L；蛋白胨 10 g/L；pH 7.0～7.2。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高壓均質(zhì)機(jī)：ATS AH 2100 型，ATS 工業(yè)系統(tǒng)有限公司；

高速剪切乳化均質(zhì)儀：T 25 Digital 型，德國 IKA 公司；

pH計(jì)：EF20 型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；

磁力攪拌器：C-MAG MS7 型，德國 IKA 公司；

動(dòng)態(tài)光散射儀：Omni 型，美國布魯克海文儀器公司；

超凈臺(tái)：SW-CJ-2D 型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-250B-Z 型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 乳液制備 參照文獻(xiàn)方法[6]制備乳液：在酪蛋白酸鈉溶液(0.25 g/100 g)中加入白藜蘆醇溶液(70%無水乙醇溶解配制成 35 mg/mL)，攪拌混合 30 min 后，加入菊粉或阿拉伯膠溶液(2.0 g/100 g )，再加入牛至精油混合均勻，去離子水補(bǔ)足體系；經(jīng)過 13 000 r/min 剪切 1 min，50 MPa 均質(zhì) 1.5 min 后得到乳液。葵花籽油代替牛至精油的乳液狀作為參比體系。

1.2.2 乳液的表征 動(dòng)態(tài)光散射儀測定乳液的粒徑，多分散系數(shù)(PDI)和 ζ -電位，散射角度為 173°，乳液用去離子水 1∶100 稀釋后在 25 ℃ 下測定。所有測定均重復(fù) 3 次。

1.2.3 抑菌劑對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的最小抑菌濃度 (MIC)

常量肉湯稀釋法測定牛至精油、白藜蘆醇對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的最小抑菌濃度。抑菌劑用 BPY 液體培養(yǎng)基倍比稀釋，制成一系列濃度的溶液。無菌條件下，100 μL 不同濃度的抑菌劑加入 10.0 mL 液體培養(yǎng)基中，再加入 100 μL 菌液(最終濃度為 5.4×105CFU/mL)， 37 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后觀察結(jié)果。試管中培養(yǎng)基混濁的標(biāo)記為有菌，澄清為無菌。若乳液顏色影響觀察，則倒瓊脂平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；無細(xì)菌生長的平板對(duì)應(yīng)的最低抑菌劑濃度即為最小抑菌濃度。

1.2.4 抑菌劑對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性 平板計(jì)數(shù)法測定抑菌劑對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果。將 100 μL 抑菌劑與 0.85% 無菌生理鹽水混合，再加入一定量生長至對(duì)數(shù)期的鼠傷寒沙門氏菌菌液，體系中菌液的最終濃度為 2.7 × 107～3.4 × 107CFU/mL，室溫下共培養(yǎng) 10 min 后平板計(jì)數(shù)。設(shè)置對(duì)照組，每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù) 3 次。

1.2.5 抑菌劑在貯藏中的抑菌活性和動(dòng)力學(xué)分析 抑菌劑在 4 ℃ 和 25 ℃ 貯藏，定期取樣進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，方法參照 1.2.4。

貯藏中抑菌動(dòng)力學(xué)[10]按式 (1) 計(jì)算：

lg [N/No] = (k/ 2.303)t

(1)

式中：

N——t時(shí)間鼠傷寒沙門氏菌菌落數(shù)，CFU/mL；

N0——起始時(shí)間鼠傷寒沙門氏菌菌落數(shù)，CFU/mL；

k——反應(yīng)速率常數(shù)，d-1，由 lg[N/N0] 與t的回歸曲線獲得的 - 斜率 / 2.303 得到，負(fù)號(hào)表示減少的菌落數(shù)對(duì)數(shù)在衰減。k應(yīng)為反應(yīng)速率(dy/dt)與系統(tǒng)中反應(yīng)物含量(x)的一次方成正比的反應(yīng)，即為dy/dt=kt；

t——時(shí)間，d。

1.2.6 牛至精油-白藜蘆醇及其乳液在鮮切卷心菜中的應(yīng)用 采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行研究[11]。卷心菜清洗空干后，稱重 10 g 置于超凈臺(tái)中殺菌 30 min，浸在鼠傷寒沙門氏菌菌液(6 lg CFU/mL)中 1 min，移出并在室溫下干燥 5 min，再浸在 90 mL 抑菌劑溶液中 1 min；浸漬 0.85% 生理鹽水的樣品做空白對(duì)照。樣品置于無菌培養(yǎng)皿中，密封，8 ℃ 冰箱貯藏。分別測定培養(yǎng) 0，2，4 d 的殘存菌落數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)采用方差分析(ANOVA)。數(shù)據(jù)采用 Origin 9.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳液的表征

粒徑、PDI、Zeta 電位是表征乳液穩(wěn)定性的重要參數(shù)。由表 1 可知，0.25% 酪蛋白酸鈉，0.25% 酪蛋白酸鈉與 2.0% 菊粉/阿拉伯膠乳液的 PDI 較小且 Zeta 電位的絕對(duì)值均大于 30 mV，當(dāng)體系 Zeta 電位的絕對(duì)值大于 20 mV 便可認(rèn)為是穩(wěn)定的[12]，這表明本試驗(yàn)制備的乳液具有良好的均一性和穩(wěn)定性。

2.2 牛至精油和白藜蘆醇的最小抑菌濃度

牛至精油和白藜蘆醇對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為 250 μg/mL 和 300 μg/mL。

? 同一列內(nèi)不同字母表示不同的顯著性(P<0.05)。

2.3 抑菌劑對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性

由圖 1(a) 可知，與白藜蘆醇相比，牛至精油、牛至精油-白藜蘆醇及其乳液都對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有很好的抑制效果，且牛至精油-白藜蘆醇的抑菌作用較牛至精油和白藜蘆醇單獨(dú)使用的抑菌效果疊加值高，說明牛至精油和白藜蘆醇對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有協(xié)同抑菌作用。這與 Valcourt 等[13]的研究發(fā)現(xiàn)類似，脂質(zhì)體包埋的牛至精油和抗菌素對(duì) 5 種革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的協(xié)同抑菌作用，降低菌落數(shù)達(dá)到 2.3～5.0 lg CFU/mL。

由圖 1(b)可知，0.25% 酪蛋白酸鈉-2.0% 菊粉/阿拉伯膠包埋牛至精油、牛至精油-白藜蘆醇的乳液對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑制效果明顯高于 0.25% 酪蛋白酸鈉；表明 2.0% 多糖能提高牛至精油和白藜蘆醇的抑菌效果。例如，牛至精油、牛至精油-白藜蘆醇的 0.25% 酪蛋白酸鈉-2.0% 阿拉伯膠乳液降低菌落數(shù)分別達(dá) 3.42，4.75 lg CFU/mL。當(dāng) pH 7.0 時(shí)，阿拉伯膠帶負(fù)電，阿拉伯膠結(jié)合在酪蛋白酸鈉表面會(huì)使乳液的空間結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[14]。包埋提高活性成分在水相中的濃度，特別是食品中微生物易聚集的區(qū)域，這提供了更多殺死微生物的機(jī)會(huì)[13]。

由圖 1(c)可知，牛至精油濃度為 200 μg/mL，白藜蘆醇的濃度由 200 ng/mL 逐漸增加到 2 500 ng/mL 時(shí)，抑菌劑乳液的抑菌效果有所提高，濃度為 1 500 ng/mL 的抑菌效果最優(yōu)。例如，酪蛋白酸鈉和阿拉伯膠乳液中白藜蘆醇的濃度由 200 ng/mL 增加到 1 500 ng/mL 時(shí)，降低菌落數(shù)分別為 4.53，5.25 lg CFU/mL。然而，牛至精油濃度由 200 μg/mL 增加到 300 μg/mL 時(shí)，酪蛋白酸鈉和阿拉伯膠包埋牛至精油-白藜蘆醇的乳液降低菌落數(shù)由 4.53 lg CFU/mL 顯著增強(qiáng)為 6.55 lg CFU/mL [圖1(c)、(d)]。其它抑菌劑乳液的抑菌效果也明顯增強(qiáng)。綜上可知，300 μg/mL 牛至精油-500 ng/mL 白藜蘆醇具有很好的抑菌效果。

由于最小抑菌濃度(5.4×105CFU/mL)和抑菌試驗(yàn)(2.7×107～3.4×107CFU/mL)中最終體系中的鼠傷寒沙門氏菌的菌液濃度不同，牛至精油濃度為 300 μg/mL 時(shí)能降低的菌落數(shù)高達(dá) 6.55 lg CFU/mL，而且牛至精油具有刺激性氣味。綜上考慮選擇牛至精油濃度為 300 μg/mL。白藜蘆醇的濃度由 200 ng/mL 逐漸增加到 2 500 ng/mL 時(shí)，抑菌效果增加不明顯，而且當(dāng)白藜蘆醇濃度為 1 500 ng/mL 時(shí)，其與酪蛋白酸鈉的結(jié)合達(dá)到飽和而產(chǎn)生渾濁，故選擇 300 μg/mL 牛至精油-500 ng/mL 白藜蘆醇。牛至精油通過揮發(fā)到氣相中并積聚在微生物細(xì)胞膜內(nèi)破壞結(jié)構(gòu)致使細(xì)胞死亡[4]。白藜蘆醇與過渡金屬銅離子反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生氫過氧化物而破壞細(xì)胞內(nèi)重要大分子從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8-9]。所以，推測牛至精油和白藜蘆醇因?yàn)橐志饔糜兴煌嬖趨f(xié)同抑菌作用。

2.4 貯藏過程中抑菌劑對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果和動(dòng)力學(xué)分析

2.4.1 貯藏過程中抑菌劑對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果

選擇 300 μg/mL牛至精油，500 ng/mL白藜蘆醇進(jìn)行貯藏試驗(yàn)。由圖 2 可知，0 d 時(shí)，牛至精油，牛至精油-白藜蘆醇及其乳液對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有很強(qiáng)的抑制作用，降低菌落數(shù)最大分別達(dá) 5.92，6.71，5.47，6.55 lgCFU/mL；牛至精油，牛至精油-白藜蘆醇的抑菌效果略高于其乳液。貯藏時(shí)間延長，抑菌劑及其乳液的抑菌效果逐漸降低；4 ℃ 貯藏 10 d，25 ℃ 貯藏 6 d 后，乳液的抑菌效果高于抑菌劑。乳液對(duì)牛至精油和白藜蘆醇有保護(hù)和緩釋作用，因此牛至精油-白藜蘆醇乳液具有長效而穩(wěn)定的抑菌效果[6]。

2.4.2 貯藏過程中抑菌劑對(duì)鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果的動(dòng)力學(xué)分析 由表 2 可知，除 0.25% 酪蛋白酸鈉乳液外，牛至精油-白藜蘆醇乳液對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果的k值低于牛至精油和牛至精油-白藜蘆醇。于 4 ℃ 貯藏下的牛至精油-白藜蘆醇及其乳液的k值低于 25 ℃。隨著時(shí)間延長，牛至精油的主要活性成分和白藜蘆醇逐漸氧化降解，抑菌效果變?nèi)鮗3]。而 25 ℃ 貯藏會(huì)加速牛至精油和白藜蘆醇的降解速度。

2.5 牛至精油-白藜蘆醇及其乳液在鮮切卷心菜中的應(yīng)用

由圖 3可知， 8 ℃ 貯藏的牛至精油-白藜蘆醇及其乳液對(duì)鮮切卷心菜中的鼠傷寒沙門氏菌有明顯的抑制效果。貯藏 4 d 時(shí)，牛至精油-白藜蘆醇及其 0.25% 酪蛋白酸鈉、0.25% 酪蛋白酸鈉-2.0% 菊粉/2.0% 阿拉伯膠乳液能明顯降低鮮切卷心菜中的菌落數(shù)(1.52，2.04，2.67，2.98 lg CFU/g)。牛至精油-白藜蘆醇乳液的抑菌率高于牛至精油-白藜蘆醇，添加多糖的乳液的抑菌率更高。抑菌劑及其乳液在鮮切卷心菜中的抑菌效果明顯低于培養(yǎng)基體系，可能是食品中成分復(fù)雜，阻礙了抑菌劑與微生物的接觸。Katherine 等[11]曾報(bào)道，牛至精油(0.1 mL/100 mL)處理 1 min 后的長葉萵苣于 4 ℃ 和 8 ℃ 貯藏 3 d，降低沙門氏菌菌落數(shù)分別達(dá) 0.8，0.9 lg CFU/g，而處理 2 min 后 8 ℃ 貯藏 3 d 降低菌落數(shù)達(dá) 1.3 lg CFU/g。由此可見，延長抑菌劑處理鮮切卷心菜的時(shí)間或者降低貯藏溫度，可能會(huì)更好地保護(hù)其品質(zhì)。

a, b, c, d 表示不同體系之間的顯著性，P < 0.05；x, y, z 表示不同白藜蘆醇濃度之間的顯著性差異，P < 0.05

圖3 牛至精油-白藜蘆醇及其乳液在鮮切卷心菜中的應(yīng)用

Figure 3 Application of OEO-resveratrol and emulsions in fresh cuts cabbage

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了牛至精油、白藜蘆醇及二者復(fù)合使用經(jīng)酪蛋白酸鈉和 2.0% 菊粉/阿拉伯膠包埋后對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果，及其在鮮切卷心菜中的應(yīng)用。研究結(jié)果表明，300 μg/mL 牛至精油-500 ng/mL 白藜蘆醇對(duì)鼠傷寒沙門氏菌具有很好的抑制作用，且二者表現(xiàn)出協(xié)同抑菌作用。乳液可以保護(hù)牛至精油和白藜蘆醇的生物活性，其中 2.0% 菊粉/阿拉伯膠可以顯著提高牛至精油和白藜蘆醇的溶解性和保留率來延長其抑菌作用。抑菌劑及其乳液處理的鮮切卷心菜在 8 ℃ 條件下貯藏時(shí)，一定程度上能有效地抑制鼠傷寒沙門氏菌的快速增長，保護(hù)其品質(zhì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑菌劑復(fù)合包埋可以達(dá)到單一、高濃度精油所達(dá)到的抑制效果并降低對(duì)食品品質(zhì)的破壞；包埋尤其是添加多糖后能進(jìn)一步提高抑菌劑的活性，這使得具有生物活性的天然抑菌劑復(fù)合使用，有效地抑制食品中有害微生物，作為食品保鮮防腐劑成為可能。較低溫度(4 ℃)貯藏下的抑菌劑乳液在食品體系中的應(yīng)用需要進(jìn)一步的研究。

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Preparation and antimicrobial activity of oregano essential oil and resveratrol emulsion

LI Qun-ying1LIAOHong-mei1FANGZheng1,2LIANGLi1,2

(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 2.StateKeyLabofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

Emulsions were prepared with sodium caseinate as emulsifier, inulin and gum Arabic as stabilizer, oregano essential oil as oil phase embedding resveratrol, to avoid the shortage of strong aromatic odor of oregano essential oil, low solubility of resveratrol and poor stability of them. Antimicrobial activities of oregano essential oil (OEO), resveratrol, OEO-resveratrol and their emulsions againstSalmonellatyphimuriumas well as antimicrobial effects during storage at 4 ℃ and 25 ℃ were investigated. Application in fresh cut cabbages was also preliminarily studied. The results showed that OEO and resveratrol had a synergistic inhibition effect onS.typhimurium, and 2.0% inulin and gum Arabic could improve the bacteriostatic activities of them. Emulsions could reduce the decomposition rate of OEO and resveratrol and protect their bioactivities during storage, and emulsions still showed inhibitory effect onS.typhimuriumstored at 4 ℃ for 20 days and at 25 ℃ for 12 days.S.typhimuriumon fresh cuts cabbage showed reductions from the control of 1.52 (OEO-resveratrol), 2.04 (sodium caseinate), 2.67 (sodium caseinate-inulin) and 2.98 lg CFU/g (sodium caseinate-gum Arabic) stored at 8 ℃ for 4 days, respectively.

oregano essential oil, resveratrol, encapsulation, antimicrobial activity,Salmonellatyphimurium

李群英，女，江南大學(xué)在讀碩士研究生。

廖紅梅(1983—)，女，江南大學(xué)副教授，博士。 E-mail：hmeiliao@jiangnan.edu.cn

2017—01—14

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.024