液—質聯用法同時檢測植物源性食品中4種鼠藥殘留

陳 華CHEN Hua 徐文泱 - 王云昊 - 鄒 橋 李 濤

(1. 湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410017; 2. 湖南農業大學資源環境學院，湖南 長沙 410012)

近年來，因鼠藥造成的誤食、投毒、自殺事件屢有發生，使用鼠藥非法盜獵以牟取利益的事件也時有報道。隨著此類案件的不斷出現，為公安等執法部門提供相關的檢驗技術支撐已成為順暢“行刑銜接”、維護食藥安全的強烈需求。類似食品安全事故存在突發性、隱匿性等特點，實現及時有效處置此類食品安全事故面臨較大挑戰。由于鼠藥種類繁多，而且目前尚未有任何成熟的檢測方法對食品中的鼠藥進行分析，中國政府也未發布食品中鼠藥殘留的檢測方法標準，檢測存在盲區和死角，因此有必要研發針對此類食品危害的檢測技術，為及時有效地預防、預警、應對和處置此類事故提供必要的技術支持。

現在使用的鼠藥一般分為兩種，即具有4-羥基香豆素結構和茚滿二酮類結構的化合物[1]。茚滿二酮的代表有敵鼠鈉、殺鼠酮和氯鼠酮；4-羥基香豆素有殺鼠靈、克鼠靈、氯殺鼠靈、殺鼠醚、鼠得克、溴鼠靈、噻鼠酮、氟鼠靈和溴敵隆等。這種鼠藥的特點是毒性小，效果較好，人類誤食后服用維生素K1能達到解毒效果[2]。此類鼠藥的已有檢測方法有分光光度法[3]、氣相色譜及氣相色譜質譜聯用法[4-7]、液相色譜及液相色譜質譜聯用法[8-11]。其中Hernández A M等[12]采用 LC-DAD-FLD-MS法對動物組織中的氯鼠酮、溴敵隆、溴鼠靈、鼠得克進行了檢測，前處理樣品用甲醇提取，方法簡單，回收率可達到82%～103%。Zhu等[13]采用液液試劑法分別提取毛發中的溴敵隆和溴鼠靈，以乙酸銨和甲醇作為流動相，回收率可達90.3%～109.3%，但檢出限較高，分別為0.010，0.025 mg/kg。食品中鼠藥的檢測方法研究并不多，麥沛明等[14]采用分散液液微試劑提取了大米中的溴鼠靈和溴敵隆，GC-MS上機，檢出限達0.2 μg/kg。這種方法的特點是在樣品中加入既能和水相樣品相溶又能和萃取劑相溶的試劑，將萃取劑快速注入水相樣品溶液，在分散劑-水相間形成納米級微珠，每一個微珠都可看成萃取器，使得接觸面積無限大，提高了萃取效率和富集倍數，常用于糧谷類樣品中農藥殘留的檢測。在調味品方面，朱峰等[15]建立了醬油、醋中殺鼠靈、殺鼠醚、敵鼠、氯敵鼠、溴敵隆、大隆、殺他丈、鼠得克、克滅鼠、氯殺鼠靈10種鼠藥殘留的檢測方法，經由 UPLC-MS/MS檢測并探討了電離模式對結果的影響，回收率達74.8%～112%，其中在醬油中的檢出限達到了15 μg/kg，這種高檢出限使得在實際檢測過程中可能出現假陰性的結果而影響樣品的真實判定。

本研究擬擴大食品基質范圍，并建立一種操作簡單、靈敏度較高的液相色譜-質譜法。由于植物源性食品和動物源性食品的基質相差較大，前者含色素、碳水化合物較多，后者常含蛋白質和脂肪，因此一般需要采用不同的前處理方法。本試驗擬研究植物源食品中的鼠藥殘留檢測，為后續的動物源食品中的鼠藥殘留檢測提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殺鼠靈、溴敵隆、溴鼠靈、殺鼠醚：99%，德國DrEhrenstorfer公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國Merck公司；

乙酸銨：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

PSA：分析純，上海迪馬科技有限公司；

PSA試劑管A(50 mg PSA+50 mg GCB+150 mg MgSO4)、PSA試劑管B(50 mg PSA+50mg GCB+150 mg MgSO4+50 mg C18)、PSA試劑管C(50 mg PSA+ 200 mg Na2SO4+50 mg C18)：2 mL，美國安捷倫科技有限公司；

植物源性食品：市售。

1.2 儀器與設備

液相色譜-質譜聯用儀：AB SCIEXQTRAP 4500型，美國應用生物系統公司；

離心機：Centrifuge 5804R型，德國Eppendorf公司；

分析天平：BS224s型，北京賽多利斯儀器系統有限公司；

渦混振蕩儀：CM-1000型，東京理化器械株式會社。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18 column(150 mm×4.6 mm×5 mm)；流動相A：乙酸銨水溶液(20 mmol/L)，流動相B：乙腈；流速：0.2 mL/min。進樣量：5 μL，梯度洗脫程序見表1。

1.3.2 質譜條件 電噴霧電離源，負離子模式。離子源溫度為450 ℃，氣簾氣25 mL/min，輔助氣40 mL/min。分別采用full-scan模式和tandem模式，在整個確認試驗中，4種鼠藥的特征離子和碰撞能見表2。

1.3.3 標準溶液的配制 分別準確稱取4種標樣(0.100 0 g)于100 mL容量瓶中，以丙酮稀釋至刻度，此為母液。工作液現配現用。

1.3.4 樣品前處理

(1) 糧谷類食品：將樣品勻質粉碎后，準確稱取1 g(精確至0.000 1 g)，以10 mL乙腈提取，渦混4 min后以不小于4 000 r/min離心5 min，取上清液上機檢測。

(2) 水果與蔬菜：將粉碎后的樣品準確稱取1 g(精確至0.000 1 g)，以10 mL乙腈提取，渦混2 min后以不小于4 000 r/min 離心5 min，提取上清液，并重復1次，合并上清液后，過萃取小柱，并取凈化液上機檢測。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

考察了不同流動相如甲醇-水(體積比70∶30)、甲醇-乙酸銨(體積比70∶30)、乙腈-乙酸銨(體積比70∶30)對質譜譜圖的影響(梯度洗脫條件見表1)。由圖1可知，當流動相為乙腈和乙酸銨時的色譜圖峰形較好，分離度高。故以其為本次試驗的流動相。4種鼠藥濃度在64～200 ng/mL時均呈現良好的線性關系，線性相關系數均>0.99。分別用提取試劑和空白基質配制相同系列的標準溶液上機分析，考察信號值的差別。結果表明，相同濃度空白基質配制溶液信號值與溶液配制標準溶液信號值有一定的差別，應用空白基質溶液配制。但在實際工作中，做到每一種基質均用基質空白溶液配制過于理想化，因此，以10倍信噪比(S/N)作為定量檢出限，并再提高2～3倍，得到實際檢出限見表3。由表3可知，溴敵隆和溴鼠靈這2種分子量較高的化合物檢出限相應較高，但已低于文獻[15]的檢出限。

2.2 質譜條件的優化

表3 4種鼠藥的回歸方程、相關系數、線性范圍及檢出限

Table 3 Linear equation, correlation coefficients, linearity range and LOD of 4 kinds of rodenticide residues

選用ESI正離子模式對母離子進行全掃，結果可得負離子模式下的離子響應值更高。以一級質譜掃描對各分子離子進行確認，發現母離子加合方式為[M+H]+。對碰撞能量以及源內碎裂電壓進行優化，并在最優電壓下選擇子離子掃描，篩選出豐度最強的離子為定量離子，次強的碎片離子為定性離子。具體參數見表2。

2.3 前處理條件的優化

糧谷類食品基質較為簡單，由于流動相為乙腈，因此采用乙腈作為提取溶劑后離心上機。在淀粉制品類添加檢出限附近1倍濃度、2倍濃度以及10倍濃度的鼠藥殘留，考察回收率及相對標準偏差后發現這種前處理可滿足技術參數的要求。

對于水果和蔬菜這類有糖分和色素類的食品基質，通過簡單的提取離心無法有效地凈化。因此選取了內含PSA的萃取柱來進行進一步的凈化。2003年美國農業部將該法用于水果蔬菜中農藥多殘留快速檢測分析。它是固相試劑和基質固相分散技術的衍生和進一步發展，其特點是溶劑用量小，操作簡便、快速[16-17]。由于水果、蔬菜類食品基質含有水分較多，在前處理過程中應注意水分的去除。先采用氯化鈉脫水并促使液液分層。在凈化階段，在萃取管中加入MgSO4以確保水分的完全去除。試驗選取了幾種內含不同吸附劑的試劑進行優化。分別為PSA、PSA+C18、PSA+GCB、PSA+GCB+C18，一般來說，GCB常用于去除色素、甾醇類和非極性干擾物，C18是除去試樣中的脂肪和酯類等雜質，PSA主要去除碳水化合物、脂肪酸、有機酸、酚類和色素。不同配比的試劑對4種鼠藥檢測回收率結果見表4。由表4可知，PSA+GCB的組合平均回收率最高，凈化液較為澄清，凈化效果較好。

2.4 回收率和精密度

為了驗證本方法的準確度和精密度，選取了3個有代表性的濃度做加標試驗，進行6次平行樣測試，方法的回收率和精密度見表5。由表5可知，RSD均<10%，在3個濃度下的加標回收率均滿足GB/T 27404—2008 對方法確認技術參數的要求。文獻[15]中的樣品基質僅限于調味品和面粉，其中10種鼠藥殘留在面粉的回收率為72.6%～120%，本試驗中4種鼠藥在植物源性食品的回收率為71.4%～95.2%，回收率的相對標準偏差較小。

2.5 專屬性

將不含標樣的空白樣品以相同凈化方法處理后上機，所得的空白樣品無陽性結果檢出。

3 結論

本試驗建立了液相色譜-質譜聯用法同時測定植物源性食品中溴鼠靈、殺鼠醚、溴敵隆以及殺鼠靈4種鼠藥殘留的方法。糧谷類制品直接以乙腈提取后上機，水果、蔬菜以乙腈提取后用PSA+GCB小柱凈化即可。該方法對植物源性食品的鼠藥殘留檢測展開了研究，在添加量為0.002～0.050 mg/kg 的情況下，殺鼠靈在植物源性食品中的平均回收率為86%，溴敵隆在植物源性食品中的平均回收率為81%，溴鼠靈在植物源性食品中的平均回收率為83%，殺鼠醚在植物源性食品中的平均回收率為92%，相對標準偏差均<10%，已滿足GB/T 27404—2008 《實驗室質量控制規范食品理化檢測》附錄F技術參數的要求。該方法適用食品范圍廣，基質干擾小，操作簡便，從樣品處理到結果分析不超過3 h，本研究僅針對植物源性食品進行了研究，可在后續研究中對動物源性食品中鼠藥殘留開展檢測工作，進一步完善食品基質范圍。

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