禽流感血凝和血凝抑制試驗的影響因素分析

郭新鋼

(烏魯木齊經濟技術開發區(頭屯河區)畜牧獸醫站,新疆烏魯木齊830023)

禽流感血凝和血凝抑制試驗的影響因素分析

郭新鋼

(烏魯木齊經濟技術開發區(頭屯河區)畜牧獸醫站,新疆烏魯木齊830023)

在進行禽流感血凝和血凝抑制試驗時,要嚴格按照操作規程,考慮多方面的因素,尤其要注意各步驟操作的細節,認真細致地進行操作,盡量消除不利影響,減少誤差,確保試驗結果的準確性。

禽流感血凝;血凝抑制;試驗

影響禽流感血凝和血凝抑制試驗結果的因素很多，因此，試驗過程中一定要注意質量控制，統一試驗標準，規范操作程序，這樣才能獲得準確、有效的試驗數據，才能科學評價免疫效果，為禽流感防控提供有力的技術支撐。

1 血清的處理及保存

1.1 溶血

造成溶血的因素有很多，像注射器或容器不干燥、不清潔；穿刺不順利，組織損傷過多；淤血時間過長；抽血速度太快；血液注入容器時未取下針頭或注入速度過快產生大量泡沫；振蕩過于劇烈等，在實際操作中都應該注意。筆者采用一次性注射器進行采血，然后帶回實驗室讓血清在注射器中自然析出，很好地避免了溶血的出現。

1.2 分離血清

采集的血樣應傾斜放置于室溫或37℃恒溫箱內（冬天常采用該方法），一般1～2h可析出血清。如果條件不允許，則應盡快送實驗室進行離心。

1.3 膠凍樣血清

筆者在多次采集血樣時，有時會遇到少數膠凍樣血清，可能與血液中脂類含量過高有關。處理辦法是用一根潔凈的玻璃或塑料棒將膠凍樣的血清挑起，在管壁上擠壓幾下，用適當的轉速和時間離心，即得到供抗體檢測的血清樣。

1.4 血清的保存

在5d內測定的血清樣品可放置于4℃的冰箱中冷藏。樣品待檢時間超過1周的，需低溫冰凍保存。保存的血清樣品一定要作好標記和封閉。有時冷凍保存的血清樣品需要多次檢測，血清需要反復凍融，這時要注意，檢測結果已不準確。筆者選擇免疫抗體水平較高的30份血清，平均分成A、B、C3組，A組被檢血清反復凍融，B組檢測抗原反復凍融，C組為對照組。3個試驗組同時做血凝抑制試驗，得到的結果是：A組抗體水平比對照組低1個滴度，B組抗體水平比對照組低2個滴度。可見樣品反復凍融對結果有影響。建議樣品反復凍融不應超過5次，對于確實需要多次分批檢測的，可將血清樣品分裝。

2 器材選用

2.1 微量血凝板

微量血凝板使用一次性塑料反應板能夠避免清洗和磨損問題。

2.2 微量移液器

微量移液器有多道和單道2種，使用前或使用一段時間后應進行校正或鑒定，使用時一定要掌握正確的操作方法，吸頭要安裝牢固，防止漏氣和掉落，手按壓時下的力度要均勻，吸取液體時一定要緩慢平穩地松開，還要注意細節問題，如預先吸取樣品溶液，然后再正式移液；吸頭管嘴浸入液面的深度不要過深等，從而盡可能地減少誤差。

2.3 移液器槍頭

移液器槍頭要選擇質量好的，槍頭光滑筆直，不易在管壁上掛液，在用多道微量移液器時一定要注意安裝上槍頭管嘴能夠并齊。

3 試驗操作

3.1 緩沖液

試驗使用的稀釋液最好為0.01mol/LpH值為7.0～7.2的等滲磷酸緩沖液（PBS），盡可能現配現用，如果用生理鹽水代替緩沖液有可能會產生誤差，因為生理鹽水不具備緩沖功能。針對稀釋液對禽流感血凝及血凝抑制試驗的影響進行了試驗研究。結果顯示，用pH值為7.0的PBS緩沖液測定抗原的血凝滴度比常用生理鹽水和調pH值至7.0的生理鹽水高出將近一倍，測定的陽性血清的抗體滴度高出一個孔。

3.2 1%紅細胞懸液

配制紅細胞懸液應采集3只或以上成年健康SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的公雞，在洗滌紅細胞時要去除表面的白細胞膜，否則將影響紅細胞的敏感性。最好用與試驗血清來源相同的禽種紅細胞，以避免易產生非特異現象。

3.3 4個血凝單位抗原

抗原必須在有效期內使用。先對抗原做血凝試驗，以抗原與紅細胞完全凝集的孔作為抗原效價，再根據抗原效價，配成4個血凝單位（HAU）抗原，4個HAU抗原要現用現配，室溫下放置不要超過4h，不可反復凍融。防止4個HAU抗原配制不準確。抗原也需要分多次使用，為避免抗原反復凍融，對實驗結果產生影響，可根據實驗樣品量將抗原分裝。

3.4 加樣

在試驗中需要加PBS、待檢血清、4個血凝單位抗原、1%紅細胞懸液。加樣時須注意以下幾點：抗原和紅細胞使用前一定要回歸室溫并充分混勻，保證每一孔中加入的濃度準確一致；注意吸頭勿碰觸到U型或V型板孔，以免發生交叉污染；加樣時應將所加物加在U型或V型板的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出；倍比稀釋血清時，移液器吸頭不要離開液面，防止產生氣泡，造成移液量不準。

3.5 孵育

凝集板在孵育靜置過程中，一定要耐心等待，不要在凝集過程中振動凝集板。孵育溫度對試驗的影響較大，從4～37℃，隨著溫度的上升，HA與HI的滴度也跟著升高。同時，溫度的高低也影響到反應的速度，溫度過低反應速度減慢，溫度過高會使反應結果洗脫加快，所以孵育溫度常控制在24℃為最佳。此外，孵育時間也須嚴格控制，一般來說，以紅細胞對照完全沉淀的前后5min內判定試驗結果較好，大約在30～40min左右。

4 結果判定

在環境溫度24℃，經過15～30min即可讀出抗原效價和血清抗體滴度。當溫度過低，出現結果要慢；環境溫度過高，超過30℃時，試驗結果出現得要快，一旦時間過長，結果就會消失，使整板無凝集現象。判讀試驗結果時，將微量反應板傾斜45°，孔底沉淀的紅細胞流動呈淚珠樣流淌，邊緣無凝集顆粒者為凝集完全抑制。

5 小結

在進行禽流感血凝和血凝抑制試驗時，一定要注意并避免以上問題，充分考慮到各方面的影響因素，才能得出準確可靠地實驗數據，準確掌握禽類的免疫抗體水平，使監測工作更具有指導性的意義，做到早發現早預防早治療，進而為科學防控禽流感提供理論依據。

[1] 徐運芳.淺談影響禽流感血凝抑制試驗的因素[J].中國獸醫雜志，2011，47（3）：84-85.