沙利度胺對前列腺癌PC3細胞的增殖及其IL—6和Cx43表達的影響

尹衛華+夏紅梅+羅小瑾+徐榮+胡小雄

[摘要]目的 觀察沙利度胺對前列腺癌PC3細胞增殖和凋亡的作用及其IL-6和Cx43表達的影響。方法 將遞增濃度6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/ml沙利度胺加入處于對數生長期的前列腺癌PC3細胞培養。采用MTT法檢測不同濃度沙利度胺對PC3細胞的增殖抑制影響，Annexin PI雙染色法檢測PC3細胞凋亡情況，ELISA法檢測PC3細胞中IL-6和Cx43的表達。結果 25.00、50.00、100.00 μg/ml沙利度胺能明顯抑制PC3細胞體外增殖，隨著時間延長、濃度增加，增殖抑制率相應升高；IL-6表達隨沙利度胺濃度增加而下降（r=-0.924，P=0.009），Cx43表達與沙利度胺濃度成正相關（r=0.915，P=0.010）。結論 沙利度胺可通過抑制人前列腺癌PC3細胞IL-6表達、上調Cx43水平，可能恢復細胞縫隙連接通訊功能來抑制腫瘤細胞增殖、誘導其調亡，從而達到抗腫瘤效果。

[關鍵詞]沙利度胺；前列腺癌；白介素-6；連接蛋白43

[中圖分類號] R737.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（b）-0008-04

[Abstract]Objective To observe the effects of Thalidomide on the proliferation and apoptosis of prostate cancer PC3 cells，as well as on the expression of the protein Cx43 and IL-6 in this cells.Methods Thalidomide with different concentrations （6.25，12.50，25.00，50.00，100.00 μg/ml） was added to PC3 cells at the logarithmic growth phase.MTT was used to detect the inhibitory effect of different concentration of Thalidomide on proliferation of PC3 cells，the apoptosis rate of PC3 cells was studied by Annexin V fluorescein isothiocyanate （Annexin PI） double staining with flow cytometry.Enzyme-linked Immunosorbnent assay method was used to detect the expression of IL-6 and Cx43 in PC3 cells.Results Below 25.00，50.00，100.00 μg/ml，Talidomide significantly inhibited the proliferation of PC3 cells in vitro，and the inhibition rate increased with the increase of time and concentration，the expression of IL-6 decreased with the increasing of concentration（r=-0.924，P=0.009），the expression of Cx43 had positive correlation with the concentration of thalidomide（r=0.915，P=0.010）.Conclusion Thalidomide can inhibit the expression of IL-6 in PC3 cells，increase the expression levels of Cx43，restore the functional refreshment of gap junction intercellular communication function in prostate cancer PC3 cells for in inhibiting the proliferation of PC3 cells and inducing its apoptosis，in order to inhibit the growth of tumor.

[Key words]Thalidomide；Prostate cancer；Interleulin-6；Connexin43

前列腺癌是目前男性最常見的泌尿系統惡性腫瘤之一，在西方國家，其死亡率位居惡性腫瘤的第2位[1-2]。近年來，我國前列腺癌發病率明顯呈上升趨勢[3-4]。早期前列腺癌采用去勢治療取得了一定的效果，18～24個月發展為激素非依賴性前列腺癌。目前激素非依賴性前列腺癌缺乏有效的治療手段，是前列腺癌患者死亡的主要原因。雖然以紫杉醇類為基礎的化療藥如多西他賽、卡巴他賽以及新藥阿比特龍，Sipuleucel-T疫苗可改善激素非依賴性前列腺癌患者短期生存，但仍然逃脫不了耐藥、免疫耐受的問題[5-6]。相關研究顯示，前列腺癌進展可能與白介素-6（interleulin-6，IL-6）、連接蛋白43（Connexin43，Cx43）有關[7-11]。IL-6是具有強烈激發雄激素受體，上調腫瘤細胞VEGF的表達，是前列腺癌進展因素之一[7-8]。Cx43是介導細胞間縫隙連接通訊（gap junctional intercellular communation，GJIC）的蛋白，為腫瘤細胞和血管內皮細胞提供連接途徑，GJIC功能受Cx43的調控；Cx43表達下降，GJIC轉移功能低可促使腫瘤細胞的生長和正常細胞的惡性表型轉化，在激素非依賴性前列腺癌的細胞生物學行為惡化過程中起決定作用[9-11]。

沙利度胺又名反應停，是一種合成性的谷氨酸衍生物，化學名稱是N-（2，6-二氧代-3哌啶基）-鄰苯二甲酰亞胺，通過抑制血管增殖、調節機體免疫，從而抑制腫瘤生長，具體機制不清楚。本課題組前期工作提示，沙利度胺能抑制IL-6，上調Cx43，本實驗旨在利用體外細胞培養來觀察沙利度胺對前列腺癌PC3細胞增殖及其IL-6、Cx43表達的影響，從細胞通訊的角度來探討激素非依賴性前列腺癌分子機制。

1材料與方法

1.1材料

人雄激素非依賴型前列腺癌PC3細胞株由南方醫科大學生物技術學院贈送。純品沙利度胺購自常州制藥廠。DMEM培養基、胎牛血清均購于美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液（100X）購自中國碧云天生物技術公司；IL-6、CX ELISA試劑盒、Annexin試劑盒均購置R&D Systems總公司；流式細胞儀：美國BD公司FACS Vantage產品，使用CellQuest軟件系統進行分析。

1.2方法

1.2.1細胞培養及增殖試驗檢測 前列腺癌PC3細胞置于含10%胎牛血清DMEM培養基，37℃ 5%二氧化碳連續培養，取生長狀態良好的PC3細胞，經0.25%胰酶消化，加入96孔板，以5×105個/孔接種到96孔培養板，每孔200 μl。實驗分為空白對照組、沙利度胺實驗組，實驗組均設6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/ml共5個濃度，每個濃度設5個復孔。細胞呈對數生長期時加藥，繼續培養48 h后，每孔加入150 μl的MTT試劑（5 g/L），培養4 h，然后棄上清液，加入100 μl二甲基亞砜，震蕩15 min。用酶標儀測定492 nm波長處（以630 nm為參考）的各孔吸光度D（λ）值，計算PC3細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=（1-實驗組D492 nm/空白對照組D492 nm）×100%。

1.2.2細胞調亡實驗 按上述實驗，離心收集各處理組的細胞，按凋亡檢測試劑說明步驟行Annexin V與碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙標染色，上流式細胞儀進行檢測。

1.2.3 IL-6和Cx43檢測 PC3細胞在培養24、48 h后，3000 r/min，4℃離心10 min，取上清液。按ELISA操作說明書檢測Cx43和IL-6蛋白的表達。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件包對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗和方差分析，計數資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1沙利度胺對PC3細胞增殖的影響

MTT法結果顯示，細胞增殖均呈現不同程度的抑制，且隨沙利度胺濃度增加、作用時間延長，沙利度胺對PC3細胞的增殖抑制作用逐漸增強，呈明顯的劑量-效應和時間-效應依賴關系。不同濃度沙利度胺作用PC3細胞24、48 h后，抑制率由1.3%增至48.6%（圖1）。

2.2沙利度胺對PC3細胞凋亡的影響

不同濃度沙利度胺作用PC3細胞48 h后，25.00、50.00、100.00 μg/ml組凋亡率分別為（8.02±0.15）、（15.70±0.23）、（48.10±0.33），空白對照組細胞的凋亡率為（0.01±0.01），不同濃度的沙利度胺組與空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）（圖2）。

2.3不同濃度沙利度胺對PC3細胞中IL-6和Cx43表達水平的影響

隨沙利度胺作用時間的延長，各實驗組Cx43表達均逐漸升高，沙利度胺藥物作用濃度最高100.00 μg/ml組表達最早且最明顯，而沙利度胺藥物濃度最低6.25 μg/ml組表達最不明顯。IL-6隨沙利度胺濃度、作用時間的延長，表達均逐漸降低，沙利度胺藥物作用濃度最高的100.00 μg/ml組表達下降最明顯，而沙利度胺藥物濃度最低的6.25 μg/ml組表達最不明顯。24 h后，100.00 μg/ml組Cx43、IL-6與其他組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；48 h后，25.00 μg/ml組、50.00 μg/ml組、100.00 μg/ml組優于空白對照組（P<0.05）。PC3細胞Cx43表達量與沙利度胺的濃度成正相關（r=0.915，P=0.010），而IL-6表達與沙利度胺濃度成負相關（r=-0.924，P=0.009）（圖3）。

3討論

激素非依賴性前列腺癌進展是多種因素、多步驟導致腫瘤微環境異常[12]，從而引起癌細胞以更惡性的生物行為復發，或獲得雄激素非依賴性增殖能力，給臨床上治療帶來困境。人Cx43主要通過形成細胞膜間的通道樣結構，為腫瘤細胞和血管內皮細胞提供連接途徑；Cx43通過細GJIC間接調控腫瘤細胞的生長和正常細胞的惡性表型轉化，在前列腺癌進展過程中起一定的作用。研究顯示，Cx43為前列腺基底細胞連接通訊點，其介導的GJIC對維持前列腺組織中的細胞穩態、調控細胞生長和分化起關鍵作用，GJIC功能異常可能會導致細胞的惡性轉化；Cx43蛋白在前列腺癌組織中表達及其強度降低，且與前列腺癌惡性程度成負相關，說明癌細胞的GJIC水平普遍下降，導致了上皮細胞異常或不能控制其生長增殖和分化，進而促進了惡性表型的進展[9-11]。此外，IL-6作為炎性因子，參與調控包括前列腺癌在內的多種腫瘤的血管形成、腫瘤發生及轉移過程，其機制多與JAK或Stat3信號通路有關。在LNCap細胞中，IL-6通過Stat3途徑激活雄激素受體（androgen receptor，AR），上調VEGF表達，從而啟動AR介導的基因表達。進一步研究證實LNCap細胞過表達IL-6，可增加前列腺特異性抗原mRNA的表達水平，降低LNCap細胞因雄激素阻斷引起的凋亡[13-15]。同時，可誘導癌細胞的上皮細胞-間充質轉化發生，與細胞間通訊功能有一定的關系[16-17]，目前機制不清楚。Cx43和IL-6均作用于腫瘤血管內皮細胞，可能使Cx43的羧基端S325與酪蛋白激酶1結合后磷酸化，影響VEGF和IL-6的表達。

沙利度胺作為抗腫瘤血管生成劑之一，能抑制相關血管生成因子如VEGF、bFGF的作用[18]，根據本課題組前期臨床經驗，在肺癌放化療應用中具有良好的療效[19]。本研究提示，沙利度胺作用于PC3細胞48 h后，凋亡率明顯高于對照組（P<0.05），誘導細胞凋亡可能是其抑制PC3細胞增殖的機制之一；同時發現，隨著沙利度胺濃度的增加，Cx43的表達增強，與腫瘤增殖明顯成負相關；而IL-6的表達量減少，腫瘤增殖也減少。進一步闡明沙利度胺作用前列腺癌的機制，通過上調Cx43和抑制IL-6表達，恢復PC3細胞GJIC的功能來抑制前列腺癌生長。

在長期應用沙利度胺治療肺癌的病例中，本課題組發現沙利度胺可以抑制IL-6的表達，但其最常見不良反應為心律失常，主要表現為房室傳導阻滯和心動過緩[19]。Cx43分布于心房和心室[20]；沙利度胺在腫瘤治療過程中，可能導致心肌Cx43的細胞縫隙連接的數量并使功能出現異常，引起心律失常，從這一個側面印證了沙利度胺對Cx43的作用。這提示沙利度胺對IL-6和Cx43作用機制比較復雜，可能通過多條信號通路完成。本實驗初步研究沙利度胺對PC3細胞中IL-6和Cx43的表達產生一定的影響，對于其作用機制有待于進一步研究。

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（收稿日期：2016-12-28 本文編輯：方菊花）

[作者簡介]尹衛華（1976-），博士，副主任醫師，主要從事腫瘤免疫研究

通訊作者：羅小瑾（1981-），碩士，副主任醫師，主要從事泌尿外科疾病研究