類脂質(zhì)蛋白沉積癥兩家系調(diào)查及ECM1基因突變檢測

于文君 付希安 孫樂樂 王真真 劉 紅 張福仁

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·論著·

類脂質(zhì)蛋白沉積癥兩家系調(diào)查及ECM1基因突變檢測

于文君1,2付希安2孫樂樂2王真真2劉 紅2張福仁2

目的： 檢測類脂質(zhì)蛋白沉積癥二家系中細胞外基質(zhì)蛋白(ECM1)基因突變位點。方法： 提取1號家系先證者及其母親，2號家系先證者、父母、配偶及兒子外周血DNA。PCR技術(shù)擴增ECM1基因編碼序列,采用一代Sanger法對PCR擴增產(chǎn)物進行測序。結(jié)果： 1號家系先證者在7號外顯子發(fā)現(xiàn)已知突變(純合突變c.960G>A),其母親為雜合攜帶者；2號家系先證者為遺傳復(fù)合體，是上述突變位點的雜合攜帶者，此外在3號外顯子上存在1個插入突變c.142insC。結(jié)論： 類脂質(zhì)蛋白沉積癥存在遺傳異質(zhì)性。

類脂質(zhì)蛋白沉積癥； 細胞外基質(zhì)蛋白1； 突變

類脂質(zhì)蛋白沉積癥(Lipoid proteinosis, LP)，又稱皮膚黏膜透明蛋白變性(hyalinosis cutis etmucosae)或Urbach-Wiethe病，是一種罕見的常染色體隱性遺傳病。主要特點為玻璃樣物質(zhì)在各種組織中沉積引起的一系列臨床癥狀，其中聲音嘶啞多出現(xiàn)在嬰兒時期[1]；皮膚黏膜癥狀相對較晚，包括由輕微外傷或摩擦引起的口腔、面部、四肢的出血性血痂和水皰，分布于四肢伸側(cè)(尤其是肘部)的疣狀皮膚增生、蠟樣丘疹[2]，眼瞼的串珠樣丘疹(多個串珠丘疹沿著眼瞼邊緣和內(nèi)眼角分布)等[3,4]。此外還常伴有皮膚以外的表現(xiàn)，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變和神經(jīng)精神癥狀，如癲癇和行為異常及顳葉和海馬鈣化[5,6]。部分患者口腔、咽部、舌浸潤可引起頜下腺炎癥、舌系帶縮短造成舌縮短難以伸出[7]。皮損組織病理：蘇木紫伊紅染色顯示廣泛的玻璃樣物質(zhì)沉積并破壞基底膜，對玻璃樣物質(zhì)進行染色，剛果紅和PAS染色陽性但淀粉酶染色陰性[8]，提示沉積物可能為糖蛋白和(或)蛋白聚糖。

該病普遍認為與細胞外基質(zhì)蛋白1(Extracellular matrix protein 1，ECM1)缺乏有關(guān)。其編碼基因ECM1位于1q21，至今已報道56例突變與LP相關(guān)(HGMD Professional 2016.3, http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)。本文對山東省2例LP家系進行基因檢測。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 1號家系先證者，男，7歲。聲音嘶啞7年伴雙眼瞼皮損1年。患者系第2胎，第2產(chǎn)，足月順產(chǎn)，父母非近親結(jié)婚，家族中無類似病例。體檢：身高、智力發(fā)育正常，無明顯的神經(jīng)精神異常，無癲癇病史。皮膚科查體：雙眼瞼上緣見淺黃色透明狀珍珠樣丘疹，面部少量淺表凹陷性瘢痕，股溝處見暗紅色浸潤性斑片(圖1a、b)。2號家系先證者為我院就診的另一例類脂質(zhì)蛋白沉積癥患者，詳細資料見文獻[9]。

1.2 外周血DNA制備 經(jīng)患者及其家屬同意，分別抽取1號家系先證者及其母親的外周血，2號家系先證者、父母、配偶及兒子外周血各5 mL于2% EDTA抗凝管中，使用QuickGene DNA whole blood kit L提取試劑盒提取基因組DNA。正常對照選取山東省皮膚病性病防治研究所中心實驗室保存的100份山東省正常漢族人群DNA樣本。

1.3 ECM1基因突變檢測 針對ECM1基因10個外顯子共合成8對引物[英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司]，其中外顯子2/3、6為自行設(shè)計，4/5按照文獻[10]，其余按照文獻[1]合成。PCR采用25 μL體系，包括2xPCR Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，基因組DNA(50 ng/μL)0.5 μL，ddH2O 10 μL。于基因擴增儀(ABI Veriti96 PCR)進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，之后共35個循環(huán)包括94℃變性30 s、60℃復(fù)性45 s、72℃延伸1 min。反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳進行產(chǎn)物驗證。應(yīng)用3130XL基因分析儀直接測序。

2 結(jié)果

對1號家系(圖2a)2名成員進行檢測，先證者(F1II1)在7號外顯子存在一純合同義突變c.960G>A，ENST00000369049(圖2b)。既往實驗發(fā)現(xiàn)該位點突變產(chǎn)生的潛在剪切受體位點可使ECM1基因發(fā)生剪切改變[11]。先證者母親(F1I2)存在該位點的雜合突變(圖2c)。

對2號家系(圖3a)的5名成員PCR產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)，先證者(F2II1)為遺傳復(fù)合體，是1號家系突變位點的雜合攜帶者，即第960位點為G/A雙峰，但是該突變并非遺傳自其父母，而是自然產(chǎn)生；同時在3號外顯子存在1個插入突變c.142insC(圖3b)，先證者母親(F2I2)及兒子(F2III1)均為該突變雜合攜帶者(圖3c)。在既往本院收集的8000份正常人外顯子測序結(jié)果中進行對比未發(fā)現(xiàn)c.142insC突變。

圖1 1a：1號家系先證者(F1II1)雙眼瞼上緣見淺黃色透明狀珍珠樣丘疹，面部少量淺表凹陷性瘢痕；1b：1號家系先證者股溝處暗紅色浸潤性斑片(箭頭所示)

圖2 2a:1號家系圖;2b:1號家系先證者7號外顯子c.960G>A純合突變;2c:1號家系攜帶者7號外顯子c.960G>A雜合突變

圖3 3a:2號家系圖;3b:2號家系3號外顯子c.142insC插入突變;3c:2號家系7號外顯子c.960G>A雜合突變

3 討論

類脂質(zhì)蛋白沉積癥是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，其主要臨床特點是聲音嘶啞，皮膚、黏膜不同程度瘢痕形成，眼瞼串珠樣丘疹，顱內(nèi)鈣化等。至今已有超過300例LP報道[12]。Hamada等[13]在2002年通過基因連鎖分析和候選對比等方法將其定位于ECM1基因，其編碼的細胞外基質(zhì)蛋白是一種分泌性糖蛋白，在表皮分化、真皮膠原和蛋白聚糖的結(jié)合、調(diào)節(jié)血管生成中具有重要生理作用[14]。ECM1基因發(fā)生突變可導(dǎo)致糖脂類或鞘脂類的降解異常，纖維膠原產(chǎn)量減少同時伴有基膜膠原的增多，ECM1蛋白和其他蛋白間結(jié)合力下降、細胞外基質(zhì)穩(wěn)定性下降，繼而細胞間穩(wěn)定性被削弱，最終造成皮膚或黏膜的易損。我們對山東省的兩個LP家系進行基因分析，最終發(fā)現(xiàn)2處突變位點，其中7號外顯子上的c.960G>A在兩家系中均存在，該位點的雜合突變首次報道為1例山東LP患者[11]，且證明該突變可導(dǎo)致ECM1基因的剪切發(fā)生改變，造成氨基酸序列變化。在1號家系先證者(F1II1)中首次發(fā)現(xiàn)該位點的純合突變，其母(F1I2)為雜合攜帶，其父(F1I1)基因型未知。2號家系先證者(F2II1)為遺傳復(fù)合體，是上述突變位點的雜合攜帶者，有趣的是該患者父母均不含有該突變，該位點為自然突變產(chǎn)生；此外，在3號外顯子上存在1個插入突變c.142insC，造成移碼突變，這是目前報道的第4例單堿基插入突變；家系中(F2III1)僅遺傳了插入突變，提示2號家系先證者(F2II1)的兩個突變位點位于不同染色體上。我們已根據(jù)情況為2號家系提供生育方面的遺傳咨詢，也將繼續(xù)為其他患者或風(fēng)險位點攜帶者提供遺傳咨詢。

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(收稿：2016-12-07 修回：2016-12-25)

Mutation analysis of ECM1 gene in two families with lipoid proteinosis

YUWenjun1,2,FUXi'an2,SUNLele2,WANGZhenzhen2,LIUHong2,ZHANGFuren2.

1.JinanUniversity,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China; 2.ShandongProvincialInstituteofDermatologyandVenereology,Jinan250022,China

LIUHong,E-mail:hongyue2519@hotmail.com

Objective: To detect the mutations in the extracellular matrix protein 1 (ECM1) gene in two families with lipoid proteinosis (LP). Methods: Genomic DNA was extracted from peripheral blood of the propositus and the mother in family one and of the propositus, wife, parents and son in family two. The family numbers were all normal except propositus in two families. All the exons of ECM1 were amplified by PCR and the products were purified and directly sequenced to detect mutations by Sanger sequencing. Results: A homozygotic mutation of c.960G>A in exon 7 in the propositus and the heterozygous mutation of c.960G>A in the mather of family 1 was identified. One insertion mutation of c.142insC in exon 3 in the propositus and the heterozygous mutation of c.960G>A in the propositus of family 2 were identified. Conclusion: There exist genetic heterogenicity of LP.

lipoid proteinosis; extracellular matrix protein 1; mutation

山東省自科科學(xué)基金博士基金(編號：BS2013YY010)

1濟南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東濟南,250062

2山東省皮膚病性病防治研究所，山東濟南,250022

劉紅，E-mail：hongyue2519@hotmail.com