清熱利濕飲通過調(diào)控FBW7影響HaCaT細胞Cyclin E的表達

孫淑娜 黃啟騰 魏海峰 李廣遠 趙 穎 張曉杰

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·論著·

清熱利濕飲通過調(diào)控FBW7影響HaCaT細胞Cyclin E的表達

孫淑娜1黃啟騰1魏海峰2李廣遠3趙 穎1張曉杰1

目的： 明確清熱利濕飲調(diào)控HaCaT細胞內(nèi)Cyclin E表達的機制。方法： Western blot檢測HaCaT細胞蛋白半衰期；免疫沉淀及Western blot檢測蛋白泛素化水平；Western blot及Real-time PCR檢測清熱利濕飲對E3泛素連接酶SCF-FBW7表達的影響。結(jié)果： 與對照組比較,清熱利濕飲組Cyclin E蛋白的半衰期較對照組縮短，Cyclin E蛋白泛素化水平及蛋白降解速度顯著增高，F(xiàn)BW7 mRNA與蛋白水平明顯上調(diào)。結(jié)論： 清熱利濕飲通過調(diào)控FBW7抑制Cyclin E的表達。

清熱利濕飲； Cyclin E； 泛素化； FBW7

銀屑病病理生理的重要特點之一是表皮基底層的角質(zhì)形成細胞增殖加速，細胞周期縮短，組織病理呈現(xiàn)角質(zhì)形成細胞過度增生[1]。清熱利濕飲是針對銀屑病證型的有效中藥組方，經(jīng)過臨床觀察療效顯著[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)清熱利濕飲能夠抑制角質(zhì)形成細胞HaCaT細胞增殖和Cyclin E蛋白表達下調(diào)，但機制不明[3]。為明確清熱利濕飲影響細胞增殖的分子機制，我們對其調(diào)控Cyclin E的表達機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人永生化表皮細胞HaCaT細胞株購于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心；

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶與胎牛血清：Gibco公司。Western blot用一抗，siRNA，protein A珠子：Santa cruz公司， Light Cycler 480 SYBR Green I Master：ROCHE公司。MG132，CHX， RIPA裂解液：碧云天生物技術(shù)公司。Trizol，Lipofectamine2000：Invitrogen公司。cNDA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：天根生化科技有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 清熱利濕飲藥液制備 龍膽草6 g，黃芩9 g，柴胡9 g，山梔9 g， 生地黃15 g， 牡丹皮9 g，當歸9 g，金銀花30 g，土茯苓30 g，澤瀉9 g，車前子15 g，甘草6 g，上述藥材加10倍量水浸泡1 h,煎煮至沸,保持微沸45 min,過濾,濾渣加入8倍量水再煎煮,沸騰后保持微沸0.5 h,合并兩次煎煮液，將上述中藥液減壓濃縮成200 mL，每毫升藥液含0.78 g生藥，過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜毎囵B(yǎng)時稀釋到相應終濃度。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將HaCaT細胞株接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)。隔天換液。清熱利濕飲藥物處理組使用終濃度80 μg/mL藥液的DMEM培養(yǎng)細胞48 h。

1.2.3 Realtime PCR RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR方法參照文獻[4]。將藥物處理的HaCaT細胞使用Trizol裂解提取RNA并參照說明書取2 μG逆轉(zhuǎn)錄。實時定量PCR檢測，反應體系：每10 μL反應體系包括無菌去離子水4.2 μL、Light Cycler 480 SYBR Green I Master 5 μL、cDNA 0.5 μL、逆轉(zhuǎn)錄引物0.3 μL，反應條件：94℃預變性3 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72度延伸30 s，共40個循環(huán)。，以GAPDH為內(nèi)參，應用Roche LightCycler 480自帶分析程序比較不同樣本同一目的基因的表達變化情況，并進行分析。引物序列qGAPDH-F：5'-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3'，qGAPDH-R：5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'；qFBW7-F：5′-CCTCCAGGAATGGCTAAAAA-3′,qFBW7-R：5′-AAGAGTTCATCTAAAGCAAGCAA-3′。

1.2.4 Western blot 方法參考文獻[5]。將藥物處理的HaCaT細胞使用RIPA裂解液冰上裂解提取蛋白，BCA蛋白定量，取40 μg樣品變性后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉TBS封閉，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗37℃孵育1 h，洗膜，化學發(fā)光，顯影定影。膠片曝光。

1.2.5 泛素化水平檢測 將細胞使用30 μM的MG132處理3 h，使用western及IP裂解液冰上裂解并超聲，離心提取蛋白。蛋白上清中加入1 μg anti-Cyclin E抗體，4℃條件下孵育3 h再加入50 μL protein A的珠子，4℃條件下孵育過夜。使用IP裂解液洗滌珠子3遍，每遍10 min，棄上清。加入2×蛋白上樣緩沖液至珠子中，99℃變性5～10 min，樣品進行western blot。

1.2.6 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染siRNA 將細胞鋪到6孔板中， 24 h后細胞密度達到約30%。取1.5 mL無菌Ep管，參照說明，分別加入適量無血清無抗生素的培養(yǎng)基，lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑和siRNA，混勻，室溫放置20 min。將配制好的轉(zhuǎn)染復合物加入到細胞生長的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中siRNA終濃度為50 nM。

2 結(jié)果

2.1 清熱利濕飲縮短Cyclin E的蛋白半衰期，降低蛋白穩(wěn)定性 我們前期發(fā)現(xiàn)清熱利濕飲可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Cyclin E的表達，因此我們首先分析了清熱利濕飲對Cyclin E蛋白穩(wěn)定性的影響。為了排除蛋白翻譯效率的差異對結(jié)果的影響，我們使用了蛋白合成抑制劑放線菌酮CHX(50 μg/mL)處理細胞，然后在不同時間點收取細胞蛋白，檢測細胞內(nèi)Cyclin E的蛋白含量。結(jié)果顯示不同時間點，藥物處理組細胞內(nèi)Cyclin E蛋白含量明顯少于對照組細胞，提示清熱利濕飲處理細胞內(nèi)Cyclin E蛋白含量降低速度明顯快于對照細胞，表明清熱利濕飲能明顯縮短Cyclin E的蛋白半衰期，降低其蛋白穩(wěn)定性(圖1)。

圖1 清熱利濕飲縮短Cyclin E蛋白的半衰期。藥物處理組細胞使用含80 μg/mL清熱利濕飲藥液的DMEM培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h，對照組使用含與清熱利濕飲等體積去離子水的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時間。收取細胞前使用放線菌酮CHX(50 μg/mL)處理各組細胞后在所示時間點收取細胞，提取總蛋白進行western blot檢測

2.2 清熱利濕飲促進Cyclin E的泛素化和蛋白降解 泛素-蛋白酶體降解途徑是調(diào)控Cyclin E在細胞內(nèi)表達的重要通路。因此，我們隨后使用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞。結(jié)果顯示與對照細胞(DMSO處理組)相比，MG132可有效抑制清熱利濕飲導致的Cyclin E蛋白表達下調(diào)(圖2a)，提示清熱利濕飲通過促進Cyclin E的蛋白酶體依賴的降解而降低其在細胞內(nèi)的表達。

圖2 清熱利濕飲促進Cyclin E蛋白泛素化。a.清熱利濕飲處理組和對照組細胞使用30 μM的MG132(DMSO為溶劑)或含等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)基處理3 h后，收取細胞提取總蛋白進行western blot。b.提取清熱利濕飲處理組和對照組細胞總蛋白，蛋白定量后取等量蛋白使用anti-Cyclin E抗體進行IP。IP的蛋白使用anti-Ubiquitin和anti-Cyclin E抗體進行western blot。

蛋白泛素化是促進蛋白被蛋白酶體識別而進一步被后者降解的重要信號。為了進一步明確清熱利濕飲調(diào)控Cyclin E的機制，我們檢測了清熱利濕飲對Cyclin E泛素化的影響。我們使用Cyclin E的抗體進行IP并對利用抗泛素抗體檢測Cyclin E的泛素化水平。結(jié)果顯示與對照細胞相比，清熱利濕飲處理細胞內(nèi)Cylin E蛋白泛素化水平有明顯上調(diào)(圖2b)。這些結(jié)果顯示清熱利濕飲促進Cyclin E蛋白泛素化，從而導致其蛋白酶體依賴的降解加速。

2.3 清熱利濕飲促進E3泛素連接酶(FBW7)的表達 E3泛素連接酶SCF-FBW7在調(diào)控Cyclin E泛素化中發(fā)揮著重要功能。因此，我們隨后檢測了FBW7的表達。結(jié)果顯示與對照細胞相比，清熱利濕飲處理細胞內(nèi)FBW7的蛋白和mRNA水平均有明顯上調(diào)(圖3a、3b)。隨后我們使用siRNA干擾FBW7的表達。結(jié)果顯示抑制FBW7的表達可有效恢復因清熱利濕飲處理導致的Cyclin E蛋白表達下調(diào)(圖3c),提示清熱利濕飲可通過上調(diào)FBW7的表達，促進Cylin E的泛素化和蛋白降解。

圖3 通過促進FBW7的表達實現(xiàn)抑制Cyclin E的蛋白水平。a.利用western blot分析清熱利濕飲處理組HaCaT細胞與對照組HaCaT細胞內(nèi)FBW7蛋白的表達。b.含80 μg/mL清熱利濕飲或?qū)φ盏腄MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細胞48 h，收取細胞提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用實時定量PCR分析FBW7的mRNA含量，以GAPDH mRNA為內(nèi)參 (*，≤0.05，非配對t檢驗)。c.轉(zhuǎn)染干擾FBW7的siRNA (80 nM)或等量的陰性對照siRNA入HaCaT細胞，轉(zhuǎn)染8 h后換含80 μg/mL清熱利濕飲或?qū)φ盏腄MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h，收取細胞提取總蛋白進行western blot分析

3 討論

角質(zhì)形成細胞過度增生是銀屑病皮損的重要特征之一[6]。因此，抑制角質(zhì)形成細胞增殖是治療銀屑病的重要靶點之一[7]。我們前期研究結(jié)果顯示清熱利濕飲可導致角質(zhì)形成細胞增殖減慢，DNA合成障礙并且在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Cyclin E蛋白的表達[3]。在本研究中我們進一步對清熱利濕飲轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Cyclin E的機制進行了探討。我們發(fā)現(xiàn)清熱利濕飲可促進Cyclin E泛素化。泛素化是蛋白修飾的重要方式之一，存在于生長發(fā)育、細胞周期、信號轉(zhuǎn)導等幾乎所有生物學過程[8，9]。多泛素化可導致底物蛋白被26S蛋白酶體降解，是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白表達的重要途徑[10]。我們的研究也顯示使用蛋白酶體抑制劑MG132可明顯恢復清熱利濕飲導致的Cyclin E蛋白減少，說明清熱利濕飲可促進Cyclin E的泛素化從而導致其被蛋白酶體降解。Cyclin E在細胞G1/S期轉(zhuǎn)換中扮演著重要的角色，其高表達可促進細胞增殖，并且Cyclin E在多種腫瘤中表達上調(diào)，被認為是重要的促癌基因[11，12]。此外有研究發(fā)現(xiàn)Cyclin E在銀屑病皮損中高表達[13]，提示Cyclin E表達失調(diào)可能是導致銀屑病的原因之一，因此下調(diào)Cyclin E表達從而抑制角質(zhì)形成細胞過度增殖是治療銀屑病的潛在有效途徑。我們的結(jié)果則提示促進Cyclin E泛素化蛋白降解可能是清熱利濕飲治療銀屑病的機制之一。

在泛素化這一過程中，E3泛素連接酶負責底物的特異性選擇，因此被認為是調(diào)控的核心[14]。Cyclin E泛素化受到包括SCF-FBW7和CRL4等多種E3泛素酶的影響[15，16]。我們研究顯示清熱利濕飲導致FBW7蛋白和mRNA的增多，而利用siRNA干擾其表達可部分恢復清熱利濕飲導致的Cyclin E表達下調(diào)，說明清熱利濕飲通過調(diào)控FBW7的表達從而影響Cyclin E的泛素化。由于FBW7的mRNA也有明顯上調(diào)，提示清熱利濕飲對FBW7的調(diào)控是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。需要指出的是，在實驗中我們利用siRNA 干擾FBW7的表達。盡管siRNA干擾后清熱利濕飲處理細胞內(nèi)FBW7的表達與對照細胞相比沒有明顯差異，但也只能部分恢復清熱利濕飲導致的Cyclin E的蛋白減少，說明清熱利濕飲轉(zhuǎn)錄后調(diào)控Cyclin E表達還有非依賴FBW7的生物學途徑。總之，這些結(jié)果表明清熱利濕飲治療銀屑病的部分療效是通過抑制Cyclin E的表達而進一步對異常增生角質(zhì)細胞的增殖進行抑制而實現(xiàn)的。此外，鑒于FBW7在Cyclin E表達調(diào)控以及細胞增殖中的重要作用，針對其開發(fā)相應的靶向藥物也可能成為未來銀屑病治療的可選方法之一。

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(收稿：2016-09-29 修回：2016-11-16)

The expression of Cyclin E affected by Qingrelishi recipe through regulating FBW7 in HaCaT cells

SUNShuna1,HUANGQiteng1,WEIHaifeng2,LIGuangyuan3,ZHAOYing1,ZHANGXiaojie1.

1.DepartmentofDermatology,AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250012,China; 2.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China; 3.AgriculturalBankofChinaShandongBranch,Jinan250014,China

ZHANGXiaojie,E-mail:qlzxj@126.com

Objective: To determine the mechanism of the expression of Cyclin E affected by Qingrelishi recipe in HaCaT cells. Methods: Half-life of Cyclin E in HaCaT cells was detected by Western blot. The ubiquitination level of Cyclin E was detected through IP and Western blot. The level of ubiquitin ligase E3 SCF-FBW7 affected by Qingrelishi recipe was detected by Western blot and Real-time PCR. Results: Compared with control group, the Half-life of Cyclin E was shorter, the ubiquitination level and the degradation speed of Cyclin E were higher and the level of FBW7 mRNA and protein was higher in the Qingrelishi recipe group. Conclusion: Qingrelishi recipe can inhibit the Cyclin E expression through the regulation of FBW7.

Qingrelishi recipe; Cyclin E; ubiquitination; FBW7

山東省自然科學基金資助項目(編號：ZR2012HM075)

1山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院皮膚科，濟南,250011 2山東中醫(yī)藥大學，濟南,250355 3中國農(nóng)業(yè)銀行山東分行，濟南,250014