安宮牛黃丸對脂多糖致急性肺損傷大鼠肺組織Nrf2蛋白表達的影響

金玉珍，曹平

(重慶市璧山區人民醫院急救部ICU，重慶 402760)

安宮牛黃丸對脂多糖致急性肺損傷大鼠肺組織Nrf2蛋白表達的影響

金玉珍，曹平

(重慶市璧山區人民醫院急救部ICU，重慶 402760)

目的探討安宮牛黃丸對脂多糖引起的急性肺損傷的保護機制。方法將40只SD大鼠按隨機數字表法分為對照組(Control組，n=10)、脂多糖組(LPS組，n=10)、脂多糖+安宮牛黃丸組(LPS+AG組，n=10)和安宮牛黃丸組(AG組，n=10)。采用一次性腹腔注射脂多糖30 mg/kg建立大鼠急性肺損傷模型。分別檢測各組大鼠肺濕重/干重比、支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度和白細胞計數、肺組織超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量、肺組織內轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2)水平。結果LPS+AG組肺組織SOD活性為(325.67±7.85)kU/g，明顯高于LPS組的(298.75±6.25)kU/g，差異有統計學意義(P＜0.05)。MDA、INF-α含量分別為(1.89±0.35)μmol/L、(35.21±3.12)ng/g，均低于LPS組的(2.78±0.41)μmol/L、(41.52±4.87)ng/g，差異均有統計學意義(P＜0.05)。LPS+AG組肺組織Nrf2蛋白表達為(0.87±0.19)，明顯高于LPS組的(0.34±0.11)，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論安宮牛黃丸對脂多糖誘發的急性肺損傷具有保護作用，可能與其能激活肺組織Nrf2表達有關。

安宮牛黃丸；脂多糖；急性肺損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛；腫瘤壞死因子α；轉錄因子NF-E2相關因子2

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是多種原因導致的常見臨床綜合征，可以視為輕度的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，部分患者將會進一步發展為嚴重的ARDS，增加臨床救治難度，故ALI一直是基礎及臨床研究中的重點及難點[1]。膿毒癥誘導的ALI/ARDS臨床中十分常見，往往也是多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)發生的啟動原因。既往已對ALI做了大量基礎及臨床研究，同時也采取了一系列的治療措施，但總體臨床救治效果仍不理想，死亡率仍較高，仍需進一步研究完善[2-3]。祖國醫學對于危急重癥救治積累了豐富經驗，也開發出了較多的經過驗證有效的中藥制劑。安宮牛黃丸是中醫危重病癥急救要藥之一，現代醫學研究發現其藥理作用極其豐富，對多種疾病均有明確的救治療效。部分研究表明安宮牛黃丸對膿毒癥大鼠有多器官功能保護作用并能降低死亡率，其中肺保護作用是重要的一環，但對于安宮牛黃丸肺保護作用機制尚不完全明確[4]。近年來研究表明部分藥物對ALI的保護機制與轉錄因子NF-E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)信號通路密切相關[5-7]。本研究通過觀察安宮牛黃丸對脂多糖誘發的ALI的保護作用及其與肺組織內Nrf2表達的關系，探索安宮牛黃丸緩解脂多糖性ALI的作用機制，為安宮牛黃丸的臨床應用提供相關的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 安宮牛黃丸(生產批號111004，杭州市胡慶余堂有限公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/兔抗小鼠IgG、Western blot檢測試劑盒購自美國Upstate Biotechnology公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體、Nrf2兔多克隆抗體、ABC試劑盒由北京博奧森生物技術有限公司提供。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實驗動物分組及模型制作 40只清潔級Spragne-Dawley(SD)大鼠，體質量(220±40)g，由第三軍醫大學動物實驗中心提供。實驗前大鼠禁食12 h，稱重后編號，按隨機數字表分為四組：對照組(Control組)，腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS液)；內毒素組(LPS組)，腹腔注射30 mg/kg脂多糖；內毒素+安宮牛黃丸組(LPS+AG組)，腹腔注射30 mg/kg脂多糖，同時造模前0.5 h和造模后6 h按2.0 g/kg劑量灌胃安宮牛黃丸；安宮牛黃丸組(AG組)，腹腔注射磷酸鹽緩沖液，注射前0.5 h和注射后6 h按2.0 g/kg劑量灌胃安宮牛黃丸。對照組、內毒素組大鼠灌胃等容積蒸餾水。

1.3 肺濕重/干重測定 40只大鼠按上述處理，在脂多糖注射后48 h按頸椎脫臼法處死，剪開胸腔，暴露肺組織，取右肺中下葉稱取濕重(wet weight，W)，再置于80℃烤箱中24 h至重量恒定即干重(dry weight，D)。計算肺組織濕重/干重比值。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)蛋白濃度和白細胞(white blood cell，WBC)計數 按規定時間處死大鼠后立即開胸取肺，切開右主支氣管，插入長約5 mm細塑料軟管，手術線加以固定，消毒血管鉗結扎左肺，用無菌生理鹽水灌洗右肺3次(每次3 mL)并回收灌洗液，最后回收到約7 mL BALF；用毛細玻璃管取80 μL，注入乙酸溶液中進行白細胞計數。將剩余的BALF以1 500 r/min離心15 min，取上清液置于-80℃冰箱保存，用于測定蛋白濃度。

1.5 肺組織中SOD和MDA測定 取大鼠左肺組織用預冷的生理鹽水在玻璃勻漿器內充分勻漿，制備為10%組織勻漿，4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照測試盒說明書測定SOD、MDA含量。

1.6 肺組織中TNF-α水平含量測定 取左肺組織用預冷的生理鹽水在玻璃勻漿器內充分勻漿，制備為10%組織勻漿，4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用雙抗體夾心ELISA法按試劑盒說明書要求操作，顯色后經全自動酶標儀讀數測定TNF-α蛋白含量。

1.7 Westen-bolt法檢測肺組織Nrf2表達 Western blot檢測采用常規法進行操作。取肺組織裂解30 min后，移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，然后12 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液置于-80℃保存；Lowry法測定總蛋白量。每孔加樣量為20 μg蛋白，將上樣緩沖液加入制備的樣本中，混勻，煮5 min，10 000 r/min離心10 min，等量上樣于7.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE電泳)。電泳畢，將蛋白轉移到PVDE膜，用新鮮配制的含3%脫酯奶粉的PBS液封閉；滴加Nrf-2一抗(抗體濃度1:1 000)過夜，次日應用辣根過氧化物酶標記的二抗(抗體濃度1:2 000)孵育，最后用化學發光法，X線片顯影。蛋白雜交條帶進行相對密度掃描并分析。

1.8 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，正態分布的計量數據多組間均數比較采用單因素方差分析后兩兩比較行q檢驗(Newman-Keuls法)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺濕重/干重測定 與Control組比較，LPS組、LPS+AG組濕重/干重比值明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.05)；LPS+AG組濕重/干重比值較LPS組下降，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肺組織濕重/干重比值情況(±s)

表1 各組大鼠肺組織濕重/干重比值情況(±s)

注：與Control組比較，aP＜0.05；與LPS組比較，bP＜0.05。

組別 只數 肺組織濕/干質量比較Control組LPS組LPS+AG組AG組F值P值10 10 10 10 4.27±0.25 6.31±0.78a5.03±0.51ab4.02±0.22b43.15 0.000

2.2 BALF蛋白含量和白細胞計數 LPS組48 h后大鼠BLAF蛋白濃度和白細胞計數較Control組明顯增加(P＜0.05)；LPS+AG組大鼠BLAF蛋白濃度和白細胞計數較LPS組明顯下降(P＜0.05)，AG組大鼠BLAF蛋白濃度和白細胞計數與Control組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 肺泡灌洗液中白細胞計數及蛋白含量變化(±s)

表2 肺泡灌洗液中白細胞計數及蛋白含量變化(±s)

注：與Control組比較，aP＜0.05；與LPS組比較，bP＜0.05。

組別 只數 蛋白含量(mg/L)白細胞計數(×107) Control組LPS組LPS+AG組AG組F值P值10 10 10 10 102.27±20.18 197.18±41.02a152.38±29.43ab106.25±21.45b125.48 0.000 4.12±0.29 7.32±0.48a5.03±0.33ab4.21±0.27b37.87 0.000

2.3 肺組織SOD活性和MDA、TNF-α含量測定 與Control組比較，LPS組48 h后大鼠肺組織SOD活性明顯降低(P＜0.05)，MDA、INF-α含量顯著升高(P＜0.05)；LPS+AG組SOD活性亦有降低，MDA、INF-α有升高，但較LPS明顯改善(P＜0.05)；AG組與Control組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

2.4 肺組織Nrf2表達 Control組肺組織Nrf2蛋白少量表達；LPS組48 h后大鼠肺組織Nrf2表達增強；LPS+AG組Nrf2表達在此基礎上進一步增強；AG組Nrf2表達較Control組、LPS組明顯增強，見圖1。

圖1 肺組織Nrf2表達

3 討論

ALI/ARDS是臨床上常見的危重急癥，臨床上很多疾病都容易誘發內毒素相關性ALI。脂多糖是內毒素的主要成分之一，其進入機體后將通過一系列變化導致ALI的發生發展，其中機體氧化還原失衡為重要原因。研究表明機體接觸刺激因子后啟動自我保護機制，表現為消除化學物及機體內過多的活性氧，阻止細胞脂質過氧化的發生來減輕損傷程度。近年來研究發現抗氧化防御系統相關酶的激活與Nrf2密切相關[8-9]。Nrf2是細胞氧化應激反應中的關鍵因子，是細胞抗氧化反應的中樞調節者，在多種炎癥性疾病的發生發展過程中起到極其重要的保護作用。Papaiahgari等[10]發現博來霉素(BLM)處理后Nrf2-/-小鼠炎癥反應、表皮細胞死亡情況及纖維化指標均重于Nrf2+/+小鼠；BLM可引起Nrf2+/+小鼠體內Nrf2表達及活性升高，抗氧化酶及II相解毒酶基因和蛋白水平上調，肺損傷和纖維化標志物蛋白表達要比Nrf2-/-小鼠更低。Lyu等[11]發現基因敲除Nrf2可以加劇小鼠膿毒癥器官損害程度，增加死亡率。另有研究發現Nrf2相關通路在吸煙誘發的肺氣腫和哮喘等疾病發生發展過程中占據重要作用[12]。部分藥物可通過促進Nrf2表達減輕各種原因導致的ALI，均提示Nrf2在細胞抗氧化反應[13-14]。

安宮牛黃丸是祖國醫學發展過程中的瑰寶，是溫病“三寶”之一，具有清熱解毒、芳香辟穢、開竅通閉之功效，漫長的中醫發展過程中已證實對溫病有獨特的療效，歷來是中醫危重癥急救要藥之一。近年來國內研究者應用現代研究技術對安宮牛黃丸及其類方成藥治療膿毒癥進行了一系列的研究。張丹等[4,15]將安宮牛黃丸應用于嚴重腹腔感染的大鼠，發現應用安宮牛黃丸后，膿毒癥大鼠肺組織高遷移族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)基因表達較對照組明顯下降，肺組織MPO活性明顯降低。同時該組大鼠ALI程度明顯減輕，死亡率可有效下降。

根據安宮牛黃丸組方為基礎，應用現代制藥技術研制而成的醒腦靜注射液是目前臨床上應用較廣泛的中成藥針劑。胡丹丹等[16]在基礎研究中發現醒腦靜注射液可通過調節機體NF-κB信號轉導通路，抑制重要的炎癥因子TNF-α表達減輕膿毒癥導致的大鼠心肌損傷，對心肌有明確的保護作用[16]。國內學者在臨床研究中將醒腦凈注射液應用于燒傷膿毒癥患者中，發現能抑制患者創面和血液中的細菌生長，減少菌血癥的發生；能有效拮抗炎性介質及內毒素的釋放，提高膿毒癥的救治療效，改善膿毒癥患者預后，進一步證實了安宮牛黃丸在膿毒癥救治中有確切的療效[17-18]。

本實驗發現內毒素誘發大鼠發生ALI時，大鼠肺組織中SOD活性降低，MDA含量增加，表明ALI時肺組織的氧化還原狀態平衡的確受到破壞，這與既往眾多研究結果一致。應用安宮牛黃丸干預的大鼠肺組織MDA含量減少、SOD活性增加，提示安宮牛黃丸可部分恢復ALI時肺組織氧化還原平衡，減輕氧化應激損害，從而減輕肺損傷的發生。ALI時因氧自由基大量釋放，超出機體抗氧化系統清除能力，導致細胞膜脂肪酸鏈斷裂使膜通透性增加，使氣血屏障的完整性被破壞及肺泡壁通透性增加等原因導致肺水明顯增加，本研究中表現為LPS組大鼠肺濕重/干重明顯大于對照組。而安宮牛黃丸干預后大鼠肺濕重/干重較LPS組明顯降低，提示安宮牛黃丸可顯著減少大鼠肺水的產生，改善氧合情況，減輕肺損傷的程度。本研究中還發現LPS可增加肺組織Nrf2表達，考慮與LPS能激活機體氧化應激系統有關，也說明Nrf2可能參與了機體保護作用。而LPS+安宮牛黃丸組及單純安宮牛黃丸組Nrf2表達顯著增強，提示其可能通過激活肺組織Nrf2表達來抑制LPS誘發的ALI程度。

本研究結果顯示安宮牛黃丸可有效抑制脂多糖誘發的急性肺損傷，這種保護性作用可能與安宮牛黃丸激活肺組織Nrf2表達，部分恢復機體氧化/抗氧化平衡有關。但安宮牛黃丸在膿毒癥救治中是否有量效關系，是否存在其他不同及機制，尚需進一步研究明確。

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Effects of Angong Niuhuang Wan on expression of Nrf2 protein in lung tissue of rats with LPS-induced acute lung injury

JIN Yu-zhen,CAO Ping.Department of Critical Care Medical,Bi'shan District People's Hospital of Chongqing,Chongqing 402760,CHINA

ObjectiveTo investigate the protective mechanism of Angong Niuhuang Wan(AG)on lipopolysaccharide-induced(LPS-induced)acute lung injury(ALI)in rats.MethodsFourty rats were randomly divided into four groups:control group(n=10),LPS group(n=10),LPS+AG group(n=10)and AG group(n=10).The ALI rat models were established by intraperitoneal injection of LPS 30 mg/kg.The lung wet/dry weight ratio,total protein concentration and WBC count in brochoalveolar lavage fluid(BALF),lung tissue superoxide dismutase(SOD)activity,malonaldehyde(MDA)and tumor necrosis factor α(TNF-α)content,lung tissue nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)levels were respectively examinated among the four groups.ResultsThe SOD activity in lung tissue of LPS+ AG group was(325.67±7.85)kU/g,which was significantly higher than that of LPS group of(298.75±6.25)kU/g,and the difference was statistically significant(P＜0.05).The content of MDA and INF-α of LPS+AG group were respectively (1.89±0.35)μmol/L and(35.21±3.12)ng/g,which were significantly lower than(2.78±0.41)μmol/L,(41.52±4.87)ng/g of LPS group,and the differences were statistically significant(P＜0.05).The expression of Nrf2 protein in lung tissue of LPS+AG group was(0.87±0.19),which was significantly higher than that of LPS group(0.34±0.11),and the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionAngong Niuhuang Wan has protective effects on LPS-induced ALI, and it may be related to the activation of Nrf2 expression in lung tissue.

Angong Niuhuang Wan(AG);Lipopolysaccharide(LPS);Acute lung injury(ALI);Superoxide dismutase(SOD);Malondialdehyde(MDA);Tumor necrosis factor-alpha(TNF-α);Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)

R-332

A

1003—6350（2017）05—0689—04

2016-09-01)

重慶市衛生計生委醫學科研項目(編號：2016MSXM180)

曹平。E-mail：zzjeicu@yeah.net

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.05.001