豬牛肉摻假鑒定技術及其特異性物質研究進展

杜洪振，趙欣欣，陳倩，孔保華

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

豬牛肉摻假鑒定技術及其特異性物質研究進展

杜洪振，趙欣欣，陳倩，孔保華*

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

目前肉品摻假現象層出不窮，這些摻假制品通過感官判斷很難區分真偽。研究表明一些現代分析技術通過檢測肉的特異性物質能夠鑒定肉的種類。本文主要以豬肉和牛肉為例，以其內在存在的種間特異性差異，從蛋白質和基因等角度分別論述各種肉的特異性物質，為肉制品摻假鑒定提供一定參考的依據。

蛋白質；基因；摻假；鑒定技術；特異性物質

原料肉的摻假問題目前是研究人員、消費者、肉類行業以及各方面決策者最關心的問題之一。近年來由于各種危害公眾安全健康事件的爆發，如禽流感、豬流感和三聚氰胺等事件，使得人們對食物的要求已從單純的好吃轉變成要吃的放心、安全。一些生產者受利益的驅動，通過摻假來獲得非法利潤，如2013年在歐洲原料牛肉中檢測到馬肉事件[1]，2014年沃爾瑪濟南泉城分店銷售的“五香驢肉”被檢出含有狐貍和貉肉的成分[2]，2015年上海市查處雞肉染色變牛肉事件[3]。摻假的方法包括在食品中使用低價值原料替代高價值的原料，減少高價值原料的使用量，通過添加成本較低的成分以保證較好的產品外觀，以及在產品中使用虛假或誤導性標簽。多數情況下，肉品摻假都是受商業利益的驅使，為了經濟目的的故意摻假。而這些摻假制品往往集中在熟食店里的熟食和包裝熟食、香腸制品、漢堡餅、肉餡、寵物食品、罐頭肉以及貼錯標簽的肉類產品[4-10]。

目前原料肉摻假鑒定技術主要是基于核酸序列，蛋白質或多肽，脂肪和光譜的鑒定，其中基于脂肪和光譜鑒定，如三酰甘油分析[11]和近紅外光譜[12]等技術使用較少，本文不再論述。原料肉的不同加工方式是造成肉品摻假鑒定困難的關鍵問題，而與鑒定方法的原理無關。因此可利用DNA或蛋白質技術通過物種的特異性鑒定原料肉和加工肉制品是否為摻假肉。甚至還可以通過DNA分析鑒定特定的物種。雖然在肉產品中檢測未申明的肉相對簡單，但是摻假肉中摻假量的表示問題一直尚未解決，故可以通過重量/重量來表示其含量[13]。近十幾年中隨著大眾消費意識的提高以及宗教信仰問題的日益凸顯，對原料肉和肉制品的安全以及肉類行業提出了更高的要求。許多學者致力于研究和開發新的技術和方法鑒定物種的來源。因此，本文對肉制品摻假技術原理和應用，以及目前所鑒定出的豬牛肉特異性物質進行綜述。

1 基于蛋白質的鑒定技術及所鑒定的特異性蛋白質

肉制品蛋白含量豐富，肌肉中除水分外主要成分為蛋白質，其中牛肉、羊肉、豬肉以及雞肉蛋白質含量分別為20.8%、20.3%、21.1%和23.1%[14]。從營養角度來說，肉是必需氨基酸的重要來源，其中牛肉中亮氨酸，賴氨酸和纈氨酸含量比豬肉、羊肉稍高，而蘇氨酸含量略低，且不同種類動物肌肉中組氨酸二肽比率差異較大，因此可以利用這些差異進行物種鑒定[15]。目前基于蛋白質檢測技術鑒定肉品特異性物質的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳法[16]，免疫印跡法[17]，高效液相色譜法[18]，酶聯免疫分析法[19]以及采用蛋白組學分析的方法[20]。

1.1 基于特異性蛋白質的鑒定技術

聚丙烯酰胺凝膠電泳法廣泛應用于分離蛋白質的亞基和測定未知蛋白質的分子量。當向樣品中加入SDS（Sodium dodecyl sulfate）和 β-巰基乙醇后，蛋白質分子解聚成多肽鏈并與SDS結合生成蛋白質-SDS膠束，從而帶上較多的負電荷，這就消除了蛋白質分子間的電荷和結構差異。其原理是利用分子量大小不同的蛋白質在凝膠中遷移率的不同，從而將不同蛋白質分開，這種方法通常適用于熟制品如商業香腸制品[21]。

免疫印跡法是一種將凝膠電泳的高分辨率與免疫學分析的高特異性相結合的高靈敏度和高分辨率的檢測技術。其原理是利用凝膠電泳的分離篩效應將混合的蛋白質分離，再利用抗原-抗體相互作用，識別特定蛋白質，然后經過顯影識別結合抗體的抗原。免疫印跡法是常用的檢測蛋白質的特性、表達情況以及分布范圍的技術。通常用于加熱/高壓滅菌肉樣的物種測定和鑒定，可選用商業試劑盒中的抗體對加熱/高壓滅菌的肉樣品進行鑒定[22-23]。因此，在分析之前需要對生肉樣品進行加熱或高壓滅菌。

肉制品中蛋白質的檢測并不局限于免疫測定。還包括高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）。高效液相色譜法是色譜法的一個重要分支，通過以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑和緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。通過液相色譜的方法已經檢測并繪制了多種蛋白質的圖譜，其中還包括各種動物物種肉來源肉制品的蛋白質圖譜[24-25]。目前，用于反芻動物的高效液相色譜法，主要集中在動物特定的組氨酸肽、肌肽和鵝肌肽的檢測，而且鯨肌肽的檢測可以達到0.5%或更高的靈敏度[26-27]。

酶聯免疫分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物的顏色反應和產物的量與標本中受檢物質量關系，進而通過判斷顏色的深淺進行定性或定量分析。測定的對象可以是抗體，也可以是抗原。ELISA技術的一般優點是可以在現場實施用于物種測定，并且可以在約15 min內獲得結果[23]。Chen[28]和Liu[29]等以單克隆抗體建立的ELISA方法對豬的熱穩定性肌肉蛋白進行鑒定，結果表明不同來源的肉類混合物中豬肉的檢測限為0.5%～0.05%。

此外，蛋白組學分析的方法也可以用于肉制品中特異性蛋白質的檢測。蛋白質組定義為一個基因組、一種生物或一種細胞或者組織在某一特定時期所表達的全套蛋白質[30]。蛋白質組學集中于動態描述基因調節，對基因表達的蛋白質水平進行定量的測定，鑒定疾病和藥物對生命過程的影響，以及解釋基因表達調控的機制。Lametsch等[31-32]利用蛋白質組學技術采集分析了宰后0、4、8、24、48 h的豬肉蛋白樣品，這些蛋白質分子量在5 kDa～200 kDa不等，pH值在4～9之間，最終確認了可作為標記的20多種蛋白質，包括肌動蛋白質、肌球蛋白質、肌鈣蛋白T以及丙酮酸激酶。

1.2 牛肉鑒定出的特異性蛋白質

牛肉肌紅蛋白含量高，且鮮切面氧合速率慢，故而肉色深[15]。Kim[17]等通過蛋白標記，特異性的鑒定出牛肌鈣蛋白的氨基酸序列在85位處為精氨酸，而豬肌鈣蛋白在此處為賴氨酸。此外，Montowska[33]在2012年比較了6種動物肌球蛋白輕鏈1和肌球蛋白輕鏈3，發現牛肉、豬肉和火雞肉所在位點均不相同，而肌球蛋白輕鏈2出現重疊，但是各物種的肌球蛋白輕鏈2分子量和等電點差異很大，因此可以通過標記牛肉肌球蛋白輕鏈1、2和3鑒定出牛肉和豬肉。同樣Montowska[34]在2013年報道中稱牛肉2-DE結果中標記一個為B476的點，通過和火雞2-DE結果中一個為T587的點比較發現，兩者均為血清白蛋白，且兩者分子質量類似，但是等電點不同，牛肉的血清白蛋白等電點為5.88，而火雞血清白蛋白等電點為5.56。此外，Negishi[35]研究了牛肉中肌鈣蛋白的特性，發現肌鈣蛋白C、I和T的分子量分別為19 500 Da、23 300 Da和40 400 Da。這就表明通過分析牛肉中肌鈣蛋白C、I和T的分子量能夠鑒定牛肉。

1.3 豬肉鑒定出的特異性蛋白質

豬肉因蛋白質含量豐富且價格低廉深受廣大消費者喜愛。除穆斯林教徒和猶太教教徒不能食用以外[36]，豬肉蛋白已經成為廣大消費者獲得動物類蛋白的主要途徑。Liu等[29]利用豬肌鈣蛋白I作為抗原，通過夾心酶聯免疫分析法制作了兩種特異性抗體MAbs 8F10和5H9，能夠檢測出牛肉中的豬肉，且最低檢測值為0.1%。而Sarah[37]通過液質聯用鑒定出熟豬肉的4條特異性多肽（EVTEFAK,LVVITAGAR,FVIEIR和TVLGNFAAFVQK）。Lametsch 等[38]通過標記 18 個 2-DE上的點最終確定了9種蛋白質作為豬肉宰后變化的標識物，它們分別是肌動蛋白，肌球蛋白重鏈，肌鈣蛋白T以及肌酸激酶，磷酸丙酮酸水合酶，肌激酶，丙酮酸激酶和二氫硫辛酰胺轉琥珀酰酶。此外，Kim等[17]通過標記牛肉和豬肉的肌漿蛋白電泳條帶發現了一條豬肉特有的條帶，經過鑒定為葡萄糖六磷酸異構酶。

2 基于核酸的鑒定技術及鑒定出的特異性核酸序列

蛋白質是基因表達的結果，它包含了有關蛋白質的組成和結構的信息。近年來DNA技術發展的同時也促進了鑒定原料肉和肉類產品真實性研究的發展?；蚍€定性高，且大部分組織細胞中均含有物種所含有的全部基因?；蜩b定需要的樣品數量少，而且可以鑒定經過高溫處理后的樣品。當樣品不具有代表性時，提取的目標DNA相對于提取的DNA總數量而言可能很少，在這種情況下，DNA的提取尤其重要。因此需要選擇合適的目標基因，高效的DNA提取方法，以及高靈敏度的檢測方法[39]。另外，某些物質也可能抑制PCR反應的過程，如糖原、脂肪乳蛋白、膠原蛋白、多糖以及美拉德反應的產物。這就需要良好的提取方法能夠在提純過程中除去這些抑制物[40]。目前通過鑒定核酸進行特異性物種識別的技術主要有，熒光定量PCR法[41-43]，隨機擴增多態性DNA標記-PCR法[44]（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）,種屬特異性PCR法[45]，多重PCR檢測法[46]和PCR-限制性片段長度多態性法[47]。

2.1 基于特異性核酸的鑒定技術

熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，并通過軟件對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。熒光染料是指雙鏈DNA的小溝結合的染料。當與雙鏈DNA結合時，熒光染料具有很強的熒光，而未結合的卻沒有，且熒光強度與雙鏈DNA的量成比例。熒光探針結合在正向和反向引物之間，并且包含連接到5′端的熒光團和連接到3′端的猝滅劑。在PCR期間，Taq酶的5′端-3′端外切核酸酶的活性將探針酶切降解，使熒光團和淬滅熒光基團分離，從而發出熒光并利于隨后的檢測。該方法雖然價格昂貴，但是能百分百鑒定物種，是一種特異性很強的鑒別方法。

RAPD是建立在PCR基礎上的一種對未知序列的基因組進行多態性分析的分子技術，其基本原理與PCR技術一致。物種特異性PCR方法是針對不同物種的差異性序列設計引物，利用短的任意引物產生一系列擴增產物，從而實現從復雜基質中較為靈敏地將目的片段進行擴增并進行成分鑒別的目的。RAPD不僅可以用于家畜的檢測，還可以用于珍稀動物的檢測，而不需要預先了解DNA序列。該方法準確、快速、簡單、方便，但屬于非特異性反應，易受樣品中其他物種DNA的干擾，因此不能進行混合樣品的鑒別。

種屬特異性PCR法是針對不同物種的差異性序列進行設計引物，從而實現從復雜基質中較為靈敏地將目的片段進行擴增并進行成分鑒別的目的。該方法的優點是無需對產物進行測序，且適用于混合樣品的檢測。

多重PCR是聚合酶鏈反應的修飾，其同時擴增許多不同的DNA片段，與簡單PCR相比，其能夠在短時間內快速檢測多種物質。而且，它更便宜且省時省力。然而在同一個管中同時使用多個PCR引物可能會引起一些問題，如產生錯誤引物的PCR產物以及引物二聚體的增加等問題。

PCR-RFLP （Restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術已經被用來作為物種特異鑒定技術。PCR擴增產物經過酶切和凝膠電泳可視化可作為單一物種的特有模式。RFLP分析物種的分化依賴于限制酶識別的特定的酶切位點，且錯誤的結果可以在限制性酶切位點隨機發生點突變，因此應該謹慎操作。事實上，限制性酶切位點的點突變可能是有利的，因為它可以區分關聯比較密切的DNA，如區分不同物種之間的牛[49]。

2.2 牛肉鑒定出的特異性核酸序列

Feligini[49-50]等使用牛特異性PCR引物，以COI基因序列為基礎，對奶牛進行定性和定量鑒定。李杰[51]等應用牛和豬線粒體序列特異性引物進行PCR擴增，只有牛肉和豬肉基因組DNA樣品能擴增出214 bp和431 bp的目的條帶，其它肉品對照基因組DNA以及陰性對照均沒有擴增產物出現。張國利等[52]對所提取的生鮮牛肉、煮熟牛肉和高壓牛肉的DNA進行PCR擴增，引物Ⅰ5′-TGT ACGAAGAAATGTGCGG-3′，位置1 641～1 659；引物Ⅱ5′-TCAATGCAAAGGACAAGC－CTGC-3′，位置 1858～1837；通過擴增均能得出 218 bp的目的DNA條帶，而豬、馬、羊、鹿、駱駝等15種動物的DNA則不能擴增出該條帶。Spychaj等[53]以COI基因序列作為雜交對象，以BTCOIF11和BTCOIR11作為引物，引物序列為5′-GAACTCTGCTCGGAGACGAC-3′和 5′-GGTACACGGTTCAGCCTGTT-3′，PCR產物大小為255 bp成功鑒定出牛肉，且能100%鑒定。Girish等[54]通過分析線粒體12S rRNA基因序列可以鑒定肉的種類。擴增12S rRNA基因的引物序列為正向 5′-CAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3′和反向 5′-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3′。

2.3 豬肉鑒定出的特異性核酸序列

Spychaj等[55]以COI基因序列作為雜交對象，以BTCOIF11和BTCOIR11作為引物，引物序列為5′-GGAGCAGTGTTCGCCATTAT-3′和 5′-TTCTCGTTTTGATGCGAATG-3′，PCR產物大小為294 bp鑒定出豬肉，且鑒定率為100%。Saez等[52]采取RAPD-PCR的方法，選擇以OPL-04和OPL-05作為引物，引物序列分別為 5′-GACTGCACAC-3′和 5′-ACGCAGGCAC-3′。分析結果表明6組之間具有82%的相似性，且至少共享了3組從1.0 kbp至0.6 kbp的強烈譜帶，從而可以將豬肉和其他肉分開。Mane等[56]使用基于線粒體16S rRNA基因設計特異性引物，成功地優化PCR測定以擴增從豬肉提取的263 bp DNA片段。優化后的PCR測定隨后用于檢驗黃牛肉、水牛肉、綿羊肉、山羊肉、豬肉和雞肉提取的DNA片段，發現引物對豬肉的識別具有特異性，并且沒有觀察到交叉反應。隨后從熱處理的肉和肉糜中提取DNA片段，經過PCR擴增，沒有發現熱處理的不利影響。Che等[57]采用物種特異PCR法，以12SFW和12SR為引物，引物序列分別為5′-CCACCTAGAGGAGCCTGTTCTATAAT-3′和 5′-GTTACGACTTGTCTCTTCGTGCA-3′，以 12S rRNA 作為目標基因，經過PCR擴增產生了針對豬肉香腸的387 bp的條帶，并且沒有產生非特異性擴增產生的片段。

3 結論

以上綜述了研究人員近年來對豬肉和牛肉肉品源追溯鑒別所使用的方法以及所鑒定的特異性物質。目前，各種基于蛋白質的鑒定技術，例如免疫印跡和高效液相色譜技術，已經能很有效地鑒別大部分常規肉制品，但對于高溫肉制品的摻假鑒定還存在不足之處。而大多數生物組織中存在DNA分子，且在高溫下具有相對高的穩定性，使得它們成為食品組分鑒定最合適的分子。但是基于DNA分析的方法還沒有開發出專門檢測物種特異性物質的技術，而且現有的檢測技術還需要進一步提高靈敏度。希望在不久的將來能開發出高靈敏度，快速，價格低廉，并且能夠分析熱加工肉和原料肉的鑒定技術。

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歡迎訂閱2018年《食品研究與開發》

《食品研究與開發》是由天津市食品研究所有限公司和天津市食品工業生產力促進中心主辦，國內外公開發行的食品專業科技期刊，1980年創刊，半月刊，采用國際流行開本大16開。其專業突出，內容豐富，印刷精美，是一本既有基礎理論研究，又包括實用技術的刊物。本刊已被“萬方數據庫”、“中文科技期刊數據庫”、《烏利希期刊指南》、美國《化學文摘》、英國國際農業與生物科學研究中心（CABI）、英國《食品科技文摘》（FSTA）等知名媒體收錄，并被列入“中文核心期刊”、“中國科技核心期刊”、RCCSE中國核心學術期刊（A）。主要欄目有：基礎研究、分離提取、研發與工藝、標準與檢測、生物工程、營養保健、貯藏保鮮、質量安全、專題論述、食品機械等。

本刊國內統一刊號CN 12-1231/TS；國際刊號ISSN 1005-6521；郵發代號：6-197。全國各地郵局及本編輯部均可訂閱。從本編輯部訂閱全年刊物享八折優惠。2018年定價：30元/冊，全年720元。

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Advances in Adulteration Identification Techniques and Specific Substances of Pork and Beef

DU Hong-zhen，ZHAO Xin-xin，CHEN Qian，KONG Bao-hua*
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

The phenomenon of adulteration in meat and meat products is an important quality and safety problem，and meat products produced by adulterated material is difficult to identify and distinguish by sensory evaluation.Some of the modern analysis technology can identify meat types by detecting meat-specific substances.In this paper，the specific substances in the pork and beef was reviewed by protein and gene identification technology in order to supplying some technical basis for identifying the adulteration in meat products.

protein；gene；adulteration；identification technology；specific substances

2017-02-19

國家重點研發計劃項目（2016YFD0401504）；黑龍江省應用技術研究與開發計劃（GA15B302）

杜洪振（1991—），男（漢），碩士研究生，研究方向：畜產品加工工程。

*通信作者：孔保華（1963—），女（漢），教授，博士生導師，研究方向：畜產品加工。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.043