水體中藍藻水華分解產甲烷動態過程研究

胡萬婷,唐 千,孫 偉,朱立峰,邢 鵬

(1.南京師范大學生命科學學院,江蘇 南京 210046；2.中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環境國家重點實驗室,江蘇 南京 210008；3.中國科學院大學,北京 100039；4.南京信息工程大學應用氣象學院,江蘇 南京 210044)

水體中藍藻水華分解產甲烷動態過程研究

胡萬婷1,2,唐 千2,3,孫 偉2,4,朱立峰1,邢 鵬2*

(1.南京師范大學生命科學學院,江蘇 南京 210046；2.中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環境國家重點實驗室,江蘇 南京 210008；3.中國科學院大學,北京 100039；4.南京信息工程大學應用氣象學院,江蘇 南京 210044)

在巢湖開展藍藻分解的原位圍隔實驗,實驗期間測定圍隔中層水體溶解性甲烷濃度和主要理化因子,通過定量PCR的方法測定產甲烷菌mcrA基因拷貝數以及細菌和古菌16S rRNA基因拷貝數隨時間的變化情況.結果顯示:隨著藍藻有機質分解,水體產甲烷菌數量逐漸增加,溶解性甲烷濃度最高達到2.94mg/L;產甲烷菌m crA基因拷貝數與甲烷濃度具有顯著的正相關關系;同時還發現水體中的亞鐵離子(Fe2+)含量與產甲烷菌的數量具有顯著的正相關關系.上述結果支持藍藻水華爆發導致水體也成為甲烷生物合成熱點區域的觀點.本研究獲得的結果有助于進一步分析不同產甲烷熱點區域(水體和沉積物)對湖泊甲烷總體釋放量的貢獻情況.

甲烷；產甲烷菌；藍藻水華；厭氧分解；巢湖

甲烷是大氣中輻射強度僅次于二氧化碳的溫室氣體,其單分子增溫效應是二氧化碳的25倍[1].大氣中甲烷濃度的持續增長是由其源匯平衡的改變引起的.土壤、濕地和湖泊等生境中微生物分解有機質的產甲烷過程對全球甲烷產量有著巨大的貢獻.據估計淡水湖泊對于自然界甲烷釋放量貢獻率為6%～16%[2-4],尤其是藻源性有機質豐富的富營養化湖泊,更有利于甲烷的生成[5],這些湖泊對局域乃至全球溫室效應的貢獻亟待定量分析和評估.

巢湖是我國污染最重的三大淡水湖泊之一[6],水體富營養化導致藍藻水華持續爆發,8月水華爆發頻度達到最大[7].微囊藻(Microcystis spp.)是巢湖夏季藍藻的優勢種[8],其柔軟的細胞壁由復雜的糖類和蛋白質構成[9],容易被破壞和消化.大量微囊藻生物質的積累和分解會消耗水體中的溶解氧[10],造成局部湖區出現缺氧,甚至厭氧條件.溶氧條件是決定有機物分解途徑和生成產物的關鍵因素[11].局部區域的缺氧會提高厭氧微生物尤其是產甲烷菌的活性.目前在巢湖還尚未開展過有關微生物驅動的產甲烷過程和機制的相關研究.

傳統觀念認為,富營養化湖泊沉積物才是甲烷產生的熱點區域[12-13],然而水體中是否有甲烷產生、其產生機制以及參與的微生物類群尚不清楚.此外,湖泊主要理化環境因子對水體產甲烷過程存在何種影響尚不明確.本研究采用氣相色譜結合熒光定量PCR(qPCR)技術,通過比較不同藍藻添加水平下,無底和有底圍隔下層水柱的溶解性甲烷濃度,分析水體細菌、古菌以及產甲烷菌甲基輔酶M還原酶A(mcrA)基因拷貝數的動態變化,試圖揭示水體中甲烷濃度動態變化的影響機制,為深入認識富營養化淺水湖泊碳循環和湖泊甲烷釋放提供野外數據支持.

1 方法

1.1 原位圍隔設置和樣品采集

2015年7月底在巢湖(北緯N31°31′49.01″東經E117°32′56.12″)岸帶設置6個圍隔,圍隔尺寸為5.0m(長)×5.0m(寬)×3.5m(深).將圍隔平分成有底圍隔(底部密閉)和無底圍隔(底部與沉積物和周圍水體聯通)2組,目的是探索在沒有沉積物參與的情況下水柱中是否存在甲烷產生所需的環境條件.藍藻直接從巢湖水面打撈富集.每組3個圍隔分別設不添加藍藻(Low),添加50L新鮮藍藻(Middle)以及添加150L新鮮藍藻(High).初始藍藻生物量以葉綠素a (Chla)濃度表示,測定結果分別為15822.57,18131.60,22336.79μg/L.實驗開始于2015年8月6日(第0d),而后于第2,5, 7,9,11,12d采集圍隔中心水深2.0m處水樣.

1.1.1 溶解性甲烷樣品的采集 用5L量程的Niskin 采水器采集圍隔下層湖水,通過乳膠管將水樣從釆水器緩慢注入100mL的玻璃頂空瓶底,避免氣泡和渦旋產生,并使水樣溢出約瓶容積的一半時,慢慢抽出乳膠管.立刻用帶聚四氟乙烯內襯的丁基橡膠塞和鋁蓋將瓶口迅速密封,并用錫箔紙包住樣品瓶身,放到黑暗的保溫箱里,低溫避光保存,盡快運到實驗室,4℃冷藏室保存,用作溶解性甲烷的測定.

1.1.2 水體理化因子分析樣品采集 現場采用水質分析儀(YSI6920,美國)測定下層水柱的溶解氧(DO)、水溫和pH.采水器里剩余的水樣用潔凈的棕色瓶子保存,用于下層水Chla、溶解性有機碳(DOC)和一些理化因子,包括總氮(TN)、總磷(TP)、硝酸根(NO3-N),亞硝酸根(NO2-N)、亞鐵離子(Fe2+)的測定.將下層水樣過濾到孔徑為0.22μm的聚碳酸酯濾膜(GTTP04700, Millipore,美國)上,用于后續對產甲烷菌、古菌和細菌DNA的qPCR定量分析.

1.2 樣品理化因子測定

TN、TP、NO3-N、NO2-N使用紫外分光光度計(UV-2450, Shimadzu公司,日本)測定. DOC分析運用總有機碳分析儀(TOC-V CPN, Shimad-Zu公司,日本).Chla采用丙酮提取法和紫外-可見光分光光度計(HP8452,Agilent Technologies公司,美國)測定.

1.3 甲烷測定

溶解性甲烷采用氣相色譜(GC7900,天美公司,上海)的FID檢測器測定,進樣口溫度160℃;柱溫90℃;FID檢測器220℃.首先取固定的水樣50mL置于120mL的頂空瓶中,水浴50℃振蕩平衡40min.用氣密性針抽取頂空上方的氣體500μL,注入色譜進樣口,點擊開始進行測樣.根據甲烷分壓-峰面積標準曲線(R2＞0.999)計算樣品甲烷濃度,結果轉化為單位體積水樣含有甲烷的質量.計算公式[14]如下:

式中:TC為溶解性甲烷濃度,mg/L;p為甲烷分壓, mol/mol;H為甲烷亨利定律常數;M為甲烷相對分子質量,g/mol;T為樣品溫度,°K;V1為頂空氣體體積,mL;V2為水樣體積,L.

1.4 水樣基因組DNA提取

將過濾水樣的濾膜剪碎,浸沒于TES lysis buffer(20mmol/L EDTA, 100mmol/L Tris, 0.8%SDS, pH 8.12),采用酚/氯仿/異戊醇方法提取DNA,將DNA溶解在30μL無菌水中備用.具體的DNA提取步驟參見文獻[15].

1.5 qPCR測定

1.5.1 標準品的制備方法 將提取的DNA分別進行細菌16SrRNA基因、古菌16SrRNA基因和mcrA基因的PCR擴增,引物序列和退火溫度見表1.PCR反應體系為50μL,其中TAKARA Premix 25μL,前向和反向引物各2μL,模板DNA 1μL,無菌雙蒸水20μL.PCR反應程序:95℃預變性5min,95℃變性45s,退火30s,72℃延伸1min,共進行30個循環,72℃延伸10min,4℃保存.PCR產物分別用1.2%瓊脂糖凝膠電泳,運用膠回收試劑盒(DNA Fragment Purification Kit, TaKaRa公司,日本)將目的基因片段割膠回收純化.標準品運用DNA濃度計(NanoDrop 2000c, Thermo Scientific公司,美國)進行DNA濃度測定.結果A260nm/A280nm為1.8～2.0,表明標準品DNA純度可以用于qPCR.根據3種標準品DNA濃度分別計算它們的基因拷貝數.換算公式如下:

式中:C為標準品濃度,ng/μL.將母液分別做梯度稀釋,制成108～104copies/μL一系列梯度濃度標準品分裝凍存備用.

表1 細菌16SrRNA,古菌16SrRNA和產甲烷菌mcrA基因qPCR引物Table 1 qPCR primers for bacterial 16SrRNA, archaeal16SrRNA and mcrA gene of methanogen

1.5.2 樣品qPCR檢測 將3種標準品分別運用到qPCR的樣品檢測中.以提取的微生物DNA作為模板.qPCR反應體系20μL:SYBR? Premix Ex Taq?(Takara,日本)10μL,引物各0.5μL,模板DNA 1μL,無菌雙蒸水8μL.qPCR反應在熒光定量儀(CFX96Touch, BIO-RAD, 美國)上完成.所有反應都設置兩個平行,以及陰性對照(以無菌水為模板).3種目標基因定量都采用3步法.細菌16SrRNA基因定量:95℃預變性2min,95℃變性15s,56℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環(熒光信號在該處采集);熔解曲線分析,溫度以1℃/30s的速度從60℃上升到95℃.古菌16SrRNA基因和mcrA基因都遵循:95℃預變性2min,95℃變性15s,53℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環;熔解曲線分析,溫度以1℃/30s的速度從60℃上升到95℃.3種標準曲線回歸方程相關系數R2＞0.999,擴增效率在92%～105%之間,說明qPCR達到了良好的擴增效果.根據樣品的Ct值計算樣品的基因拷貝數,并將單位轉化成copies/mL.

1.6 統計分析

運用SPSS20.0軟件進行統計分析.分析圍隔的有無底以及藍藻添加量的多少對各種環境因子和甲烷產量以及3種基因拷貝數的顯著性影響.對按無底圍隔和有底圍隔歸類、并且符合方差齊性的所有變量進行配對T檢驗,對不合方差齊性的變量進行2個相關樣本非參數檢驗;運用Pearson相關方法分析溶解性甲烷濃度與環境因子,如營養鹽、金屬離子、底物(Chla,有機碳)以及微生物數量(產甲烷菌,細菌,古菌基因拷貝數)的相關性.運用線性回歸模擬甲烷產量和產甲烷菌數量的函數關系.

2 結果

2.1 不同藍藻添加量對產甲烷濃度的影響

圖1 不同藍藻添加量圍隔中層水柱溶解性甲烷濃度動態變化趨勢Fig.1 Dissolved methane dynamics inmesocosms with different amount of Microcystis spp. biomass addition

實驗期間圍隔中水溫為19.9～21.5℃,pH值為6.69～7.51.湖泊環境中溶氧條件是決定有機物分解途徑和生成產物的關鍵因素.實驗開始后6個圍隔DO濃度始終均為0mg/L,指示圍隔體系中一直維持缺氧的狀態.6個圍隔中水體Chla濃度均先增加,而從第7d都大幅度減少,至第12d各圍隔Chla平均濃度為479.15μg/L(最小濃度低于166.96μg/L),僅為初始濃度的0.75%.Chla濃度的變化一定程度上反映了圍隔中藻類的消亡過程,甲烷生成的底物可能大部分來自于藍藻分解產生的有機質.

如圖1所示,大部分圍隔下層水柱中的甲烷濃度在初期都很低,隨著時間推移增加,最高可達2.94mg/L.圍隔的有無底對甲烷的產量具有顯著影響(P＜0.05,圖2).有底圍隔的水柱中甲烷濃度高于無底圍隔,尤其是當添加High水平的藍藻時,有底圍隔中的甲烷濃度一直處于最高.藍藻添加量對下層水柱甲烷產量的影響因圍隔有無底而存在差異.添加不同藍藻量的無底圍隔之間,甲烷產量差異并不顯著;而在有底圍隔中,藍藻不同添加量組間差異顯著(P＜0.05).在有底圍隔中,藍藻添加量越多,甲烷濃度越高,表明水柱中藍藻賦存量會影響甲烷產量.

圖2 不同藍藻添加量在無底和有底圍隔中溶解性甲烷濃度比較Fig.2 Comparison of dissolved methane concentration between mesocosms with and without bottoms

2.2 藍藻水華分解過程中細菌、古菌和產甲烷菌數量變化

細菌和古菌16SrRNA基因拷貝數總體上具有一致的變化趨勢(圖3).在厭氧分解初期,6個圍隔的水柱中細菌和古菌16SrRNA基因拷貝數均隨時間推移而增多,幾乎都在第5d達到峰值.細菌16SrRNA基因拷貝數最高6.85×109copies /mL,古菌的16SrRNA基因拷貝數最高也有8.22× 108copies/mL.各個圍隔的產甲烷菌mcrA基因拷貝數呈現逐步增多的趨勢,幾乎均在第11d達到峰值.其中添加High水平的有底圍隔下層水mcrA拷貝數最高可達2.15×108copies/mL,增加幅度約為初始濃度的93倍.

圖3 不同藍藻添加量圍隔細菌和古菌16SrRNA基因以及產甲烷菌mcrA基因拷貝數動態變化趨勢Fig.3 Dynamic of bacterial and archaeal 16SrRNA gene and methanogen mcrA gene copy numbers in mesocosms with and without bottomsunder different amount of Microcystis spp.

藍藻添加量和圍隔有無襯底對于細菌、古菌和產甲烷菌數量具有不同的影響.如圖4a所示,在無底圍隔中,細菌數量隨著藍藻添加量增多而增多,在無底圍隔中結果相反.統計分析顯示圍隔有無底對細菌16SrRNA基因拷貝數存在顯著影響(P＜0.05).圖4b顯示,藍藻添加量在無底圍隔中對于古菌數量的作用不明顯.但是在有底圍隔中,藍藻添加量越多,古菌數量越多.有底圍隔中古菌16SrRNA基因拷貝數顯著高于無底圍隔.圖4c表明,在有底圍隔中,產甲烷菌數量隨著藍藻添加量的增加而明顯增多.藍藻生物量對產甲烷菌具有重要影響(P＜0.05).當藍藻添加量相同時,尤其是添加藍藻量都為High水平,有底圍隔中的產甲烷菌數量顯著高于無底圍隔.

圖4 不同藍藻添加量無底和有底圍隔細菌和古菌16SrRNA基因以及產甲烷菌mcrA基因拷貝數比較Fig.4 Comparisonof bacterial and archaeal 16SrRNA gene and methanogenmcrA gene copy numbers betweenmesocosms with and without bottomsunder different amount of Microcystis spp.

圖5 水體溶解性甲烷濃度與產甲烷菌mcrA基因拷貝數的相關關系Fig.5 The correlation between methane concentration and mcrA gene copy number

產甲烷菌的數量與甲烷產量變化趨勢具有一致性,統計分析顯示產甲烷菌mcrA基因拷貝數與甲烷產量顯著正相關(Pearson r=0.855, P＜0.0001,圖5).在分解后期,添加High水平藍藻的有底圍隔中,產甲烷菌mcrA基因高拷貝數可能是高濃度甲烷產生的原因.

2.3 與產甲烷過程相關的環境因子分析

甲烷生成過程可能受到水體理化因子和微生物自身對于底物利用能力的限制.環境因子間的相關分析結果顯示,圍隔中TN、TP濃度彼此密切相關;NO3-N濃度與Chl a濃度呈負相關(r= -0.377,P＜0.01),即藍藻厭氧分解過程中隨著Chl a濃度逐漸下降,NO3-N濃度升高.相關性分析還顯示許多環境因子對產甲烷菌、細菌和古菌數量都存在潛在的影響.產甲烷菌數量與Chl a濃度和溶解性有機碳DOC均顯著正相關,藍藻生物質(以Chl a表征)分解過程向周圍水體釋放DOC,可以為產甲烷菌生命活動提供所需底物.此外還發現不論產甲烷菌mcrA基因拷貝數還是甲烷濃度都與Fe2+濃度顯著正相關.產甲烷菌、細菌和古菌的基因拷貝數變化都與TN存在顯著的正相關關系.水體中溶解性甲烷濃度除了與產甲烷菌數量相關,還與細菌、古菌數量存在正相關性.藻源性有機質降解過程是各種功能微生物共同作用的結果,某些功能菌群將藍藻有機質大分子分解成小分子量的中間產物才可被產甲烷菌利用生成甲烷.

3 討論

3.1 藍藻水華分解形成的環境條件有助于甲烷的生物合成

產甲烷過程涉及到一系列酶促反應,其代謝過程受到環境因子(如溫度、pH值和金屬離子等)的影響.大部分產甲烷菌最適生長溫度通常在4～20℃[20],實驗過程中圍隔中下層水溫平均為20.7±0.6℃,適宜產甲烷菌生長繁殖.產甲烷菌最適生長pH值為近中性環境[21],本實驗測得水體pH平均值為7.45±0.06,符合產甲烷菌對pH值的需求.

研究結果還顯示,有底圍隔水體Fe2+濃度為0.36～2.9mg/L,顯著高于無底圍隔(0.19～1.5mg/L).由于微囊藻對鐵(包括二價鐵和三價鐵[22])具有較強的吸收與儲存能力[23],分解過程導致細胞內存貯的鐵元素釋放.而且,低氧化還原電位的缺氧水體也有利于Fe2+的穩定存在[24].

相關分析顯示,圍隔水體中Fe2+與甲烷濃度具有極強的正相關性(r=0.764,P＜0.001).Fe2+對甲烷生成可能存在積極影響[25],一方面Fe2+是厭氧微生物不可缺少的微量元素,而且更是產甲烷菌生存必需元素[26],可以作為產甲烷菌的能量載體[27],另一方面Fe2+是許多酶的組成成分,還可以降低氧化還原電勢[28].我們推測Fe2+大量存在可能有助于產甲烷的生物合成.關于Fe2+促進產甲烷過程的生物學機制有待進一步研究.

3.2 湖泊厭氧水體中存在劇烈的產甲烷作用

有研究報道,產甲烷菌主要存在于湖泊沉積物和具有厭氧環境的顆粒物中[29].本研究設置有底和無底圍隔的處理,試圖明確在水柱中是否存在藻源性有機質分解產甲烷所需的環境條件,換言之,通過原位模擬實驗分析在無沉積物參與的情況下是否能夠完成藍藻有機質生產甲烷的微生物轉化過程.

關于我國富營養化淺水湖泊水體產甲烷菌數量的報到并不多見.本實驗較為系統的研究了水體中甲烷產生的環境條件以及產甲烷過程的動態變化.有底圍隔中未添加藍藻時產甲烷菌mcrA基因拷貝數就有4.64×104copies/mL,高于淡水湖泊Kivu水柱中mcrA基因拷貝數(4.15×102～3.35×103copies/mL)[18].添加High水平藍藻的有底圍隔在厭氧分解后期,mcrA基因數最高增加到初始濃度的近100倍,高達2.15×108copies /mL.這一數值超過了黑龍江、安徽、山東地區沼氣池的沼泥樣品發酵后期沼液中產甲烷菌mcrA基因拷貝數的最高值7.91×105copies/mL (僅比發酵初期的沼液中的產甲烷菌數量增加了2.1倍)[30],更遠遠高于Kivu湖夏末底層水柱中的產甲烷菌mcrA基因拷貝數(2.21×103copies /mL)[18].可見,藻源性有機質厭氧分解會引起產甲烷菌的快速增殖.

表2 主要環境因子,細菌16SrRNA、古菌16SrRNA和產甲烷菌mcrA基因之間相關系數Table 2 The correlation coefficient among major environmental factors, bacterial 16SrRNA, archaeal 16SrRNA and mcrA of methanogen

圍隔水體中溶解性甲烷產量隨著藻源性有機質厭氧分解而增多,平均峰值(1.08±0.44)mg/L,遠遠高于長江下游底層水體中甲烷的平均濃度[(0.88±0.49)×10-3]mg/L以及鄱陽湖入長江口的甲烷濃度(3.9×10-3)mg/L[31].而其他淡水湖泊,如芬蘭南部城市一個富營養化湖泊Vesij?rvi湖的下層缺氧水柱中甲烷平均濃度也只0.23mg/L[32].富營養化Kasumigaura湖水體溶解性甲烷濃度在夏末時期最高,但不超過0.056mg/L[33].藍藻水華形成后的太湖梅梁灣水柱中的甲烷含量僅有0.37～0.67mg/L[29],但水體產甲烷菌數量未見報道.不僅如此,藍藻水華分解后期水體中溶解性甲烷濃度最高達到2.94mg/L.而且當添加的外源性藍藻有機質的量越多時,產甲烷菌數量也越多,這表明藍藻生物量賦存為產甲烷菌提供厭氧環境和豐富的基質.外源有機質的累積刺激甲烷的生成[34].本研究結果表明,藍藻水華頻繁爆發的局部湖區,缺氧水體同樣可以成為產甲烷的熱點區域,因此,水華嚴重的湖泊中甲烷的生成絕不僅僅局限于沉積物中的反應過程.

4 結論

4.1 水華爆發導致的藍藻生物質堆積分解,造成水體缺氧或者完全厭氧,顯著促進了產甲烷菌的增殖.藍藻水華不僅為產甲烷菌提供了厭氧環境,還為其提供了豐富的基質.

4.2 多種環境因子對產甲烷菌的數量和溶解性甲烷濃度存在影響,水體中Fe2+的積累可能是促進甲烷生成的誘因之一.

4.3 研究證實在缺氧水體中也能發生劇烈的產甲烷過程.藻源性有機碳在湖泊多位點的厭氧分解, 將加速富營養化淺水湖泊的碳循環過程,增加溫室氣體甲烷釋放的風險.

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致謝：感謝中國科學院南京地理與湖泊研究所段洪濤研究員,杜瑛珣副研究員和佴兆駿同學對樣品采集和部分環境數據測定的協助.

Dissolved methane dynamics during the degradation of organic matter derived fromcyanobacterial bloom.

HU Wan-ting1,2, TANG Qian2,3, SUN Wei2,4, ZHU Li-feng1, X ING Peng2*
(1.College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；2.State Key Laboratory of Lake and Environment, Nanjing Institute of Geography Limnology, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China；3.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China；4.Applied Meteorological Institute, Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing 210044, China). China Environmental Science, 2017,37(2)：702～710

In shalloweutrophic lakes, methane production during the decomposition of organic matter derived fromcyanobacterial blooms and associated factors for the whole process in the water column remain poorly understood. In this work, in situ mesocosms experiment in Lake Chaohu were carried out to stimulate the Cyanobacteria anaerobic decomposition. During the process, dissolved methane concentration and the main environmental factors were measured at the water bottom. Quantitative real-time PCR method was applied to analyze the abundance of mcrA gene as well as the bacterial and archaeal 16S rRNA genes in each sample. Results showed that with the biomass decomposition, the amount of methanogens increased gradually in accordance with the accumulation of dissolved methane in the water column (maximumconcentration 2.94mg/L). A significantly positive correlation was detected between mcrA gene abundance and the dissolved methane concentration. Furthermore, there was also a significantly positive correlation between ferrous ions (Fe2+) concentration and the methanogen mcrA abundance. Our results support for the notion that water column can be a hot spot for the biosynthesis of methane due to the outbreak of cyanobacterial bloom. This study helps to compare the relative contribution of methane production between water column and surface sediments during the cyanobacterial blooms degradation.

methane；methanogens；cyanobacterial bloom；anaerobic decomposition；Lake Chaohu

X524

A

1000-6923(2017)02-0702-09

胡萬婷(1991-)女,安徽安慶人,南京師范大學碩士研究生,主要從事環境微生物學研究.發表論文1篇.

2016-06-16

國家“863”項目(2014AA06A509);國家自然科學基金資助目(31370508);中國科學院青年創新促進會(2014273);湖泊與環境國家重點實驗室開放研究基金(2012SKL005).

* 責任作者, 副研究員, pxing@nigalas.ac.cn