芝麻種質資源成株期抗旱性關聯分析

劉文萍，呂偉，黎冬華，任果香，張艷欣，文飛，韓俊梅，張秀榮

（1山西省農業科學院經濟作物研究所，太原 030031；2中國農業科學院油料作物研究所，武漢 430062）

芝麻種質資源成株期抗旱性關聯分析

劉文萍1，呂偉1，黎冬華2，任果香1，張艷欣2，文飛1，韓俊梅1，張秀榮2

（1山西省農業科學院經濟作物研究所，太原 030031；2中國農業科學院油料作物研究所，武漢 430062）

【目的】利用33個多態性SSR分子標記分別與18個不同的抗旱性狀進行關聯分析，發掘與抗旱相關的主要基因位點，為抗旱基因定位和功能標記開發提供基礎；通過對100份芝麻種質資源進行抗旱性鑒定，發掘優異的耐旱種質，為芝麻抗旱育種提供指導。【方法】采用盆栽和反復干旱法，對芝麻種質資源群體進行成株期抗旱性鑒定獲得表型指標測定值，利用SAS、SPSS和隸屬函數等進行統計分析，綜合評價其抗旱性，利用GLM模型和MLM模型，將表型數據與分子標記進行關聯分析。【結果】研究群體干旱脅迫處理后，材料間響應差異明顯，考察的表型性狀測定值均小于對照；干旱脅迫條件下18個性狀值的變異系數平均為0.31，高于對照（平均為0.19）；處理與對照間各性狀指標經配對t檢驗，均達極顯著水平；通過連續變數的次數分布統計方法、主成分分析和隸屬函數分析，篩選出10個與抗旱性響應關系密切的指標，并篩選出12份高抗旱種質；基于芝麻基因組篩選出的33個多態性SSR標記掃描供試材料，共檢測到170個等位變異，平均每個標記5.15個；利用structure數學模型對供試群體進行遺傳結構分析，可分為2個亞群；利用GLM模型和MLM模型分別檢測到120個和63個標記位點與供試群體抗旱系數顯著關聯（P＜0.05），表型變異解釋率分別為3.85%—14.30%和4.00%—12.5%，解釋率大于10%的標記位點分別有12個和3個，其中，位點4033-3和4033-2均與第一主成分因子第2次復水前萎蔫葉片數顯著關聯，且變異解釋率均為最高，分別達14.3%和12.5%，2個模型共同檢測到的標記位點有5個。通過引物序列在基因組上的位置比對，發現3個可能存在芝麻抗旱相關基因的基因組區段。【結論】利用綜合評價方法，篩選出柳林芝麻3號、g80、8602-2等12份高抗旱芝麻種質，同時利用GLM和MLM 2個模型檢測到與第2次復水前萎蔫葉片數顯著關聯的標記位點（位點4033-3和位點4033-2），且變異解釋率最高，分別達14.3%和12.5%。

芝麻種質資源；抗旱性；SSR標記；關聯分析

0 引言

【研究意義】芝麻隸屬胡麻科，一年生草本植物，是中國主要的油料作物之一，在中國有著悠久的種植歷史，多數省份皆有種植[1]。山西地處干旱半干旱地區，降水量少，干旱嚴重，導致芝麻出苗率低、生長緩慢、產量降低，成為限制芝麻增產的主要限制因子，因此，研究芝麻的抗旱性，挖掘抗旱芝麻種質資源，同時，利用SSR分子標記與抗旱性狀進行關聯分析，發掘與抗旱相關的主要基因位點，開發抗旱分子標記，并將其應用到芝麻育種中，對提高芝麻的抗旱性和產量水平具有很重要意義。【前人研究進展】國內外已對玉米、水稻、大豆、小麥、花生、油菜[2-7]等作物進行了較系統的抗旱性研究。早在20世紀70年代末，CARTER等[8]通過植株萎蔫程度對300余份大豆種質進行了抗旱性鑒定；SONGSRI等[9]、劉吉利等[10]、張智猛等[11]對花生的生長發育和生理生態等方面的干旱適應機制進行了研究；NOROUZI等[12]對甘藍型油菜研究表明，干旱脅迫下葉片含水量[13]、萎蔫指數[14]、種子活力指數[7]、相對根體積[15]以及脯氨酸[16]等生理指標發生明顯變化，千粒重、生物量等下降[17]，可作為油菜抗旱性鑒定的指標。在芝麻抗旱性研究方面國內外也有一些報道，MENSAH等[18]利用盆栽法對芝麻苗期進行間隔不同天數澆水處理研究，結果表明，

水分不足會直接影響芝麻植株的生長，株高、葉面積、地下部干重和地上部干重等降低，導致單株產量顯著下降；孫建等[19]利用盆栽試驗對芝麻苗期進行干旱脅迫研究，結果表明，芝麻苗期進行干旱處理對千粒重和產量的影響較大。【本研究切入點】作物的抗旱性屬于較復雜的數量性狀，受多基因控制[20]，關聯分析是研究復雜數量性狀的有效方法[21]，中國芝麻抗旱性分子基礎研究報道較少，僅見黎冬華等[22]采用不同濃度PEG 6000脅迫發芽芝麻種子基于SSR、SRAP和AFLP分子標記的關聯分析研究報道，而國外對芝麻抗旱性分子基礎研究還尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究通過對芝麻自然研究群體進行抗旱表型鑒定，獲得抗旱相關表型數據，并與全基因組分子標記數據進行關聯分析，發掘與抗旱相關性狀基因位點，篩選得到抗旱種質資源，為芝麻抗旱遺傳改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用來源于山西和陜西芝麻種質資源共計100份，由國家芝麻種質資源中期庫（中國農業科學院油料作物研究所）提供，并進行了4代純化。

1.2 干旱處理

試驗于2014年5月至10月在山西省農業科學院經濟作物研究所人工遮雨棚內進行，采用盆栽法[23]，每個材料種植6盆，其中3盆用于干旱處理，3盆為對照，共計600盆。盆缽口徑35 cm，盆栽土用芬蘭進口營養土與蛭石按1∶1等量混合，每盆裝3 kg，每盆澆等量的水1 L，待適墑時播種。出苗后間苗2次，每盆保留均勻生長的苗5株，在干旱處理前保持正常供水。在芝麻4對真葉展開時進行干旱處理，采用反復干旱法，處理3次，每次干旱處理后待50%左右的材料出現永久萎蔫時進行復水，之后全部材料按正常管理澆水直至成熟。

1.3 表型性狀調查

處理期調查：在干旱處理的每次復水前同一時間段內（3次復水前均在上午9：00以前）調查每株總葉片數（全展葉）、萎焉葉片數（全展葉）；每次復水后第2天早上調查每株總葉片數（全展葉）、萎焉葉片數（全展葉）。成熟期調查：調查每個材料處理和對照每株的株高、始蒴高度、單株蒴果數、單株產量、千粒重、單株地上部分生物量、地下部分生物量，計算平均值。

1.4 抗旱能力的綜合評價

各指標抗旱系數Xj=處理測定值/對照測定值；負向指標的抗旱系數Xj=1-處理測定值/對照測定值（1）

每一個材料各綜合指標的隸屬函數值由公式（2）求得[24-25]，式中，Xj表示第j個綜合指標，Xmax和Xmin分別表示第j個綜合指標的最大值和最小值。

由公式（3）計算各綜合指標的權重[24-25]，式中，Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度；Pj為各材料第j個綜合指標的貢獻率。

由公式（4）計算各材料的綜合抗旱能力（D值）。

用SPSS和SAS 9.1軟件進行相關性分析、主成分分析。

1.5 基因組DNA的提取和SSR分子標記分析

每份材料取苗期嫩葉的混合樣，采用CTAB法[26]提取基因組DNA，經紫外分光光度計法檢測其質量和濃度，稀釋至20 ng·μL-1，置-20℃冰箱保存。PCR體系及擴增程序參照文獻[27]。PCR擴增產物經6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后照相。

1.6 關聯分析方法數據統計分析

以Structure 2.3.1軟件進行群體遺傳結構分析，估計最佳群體組群數K，其取值范圍為1—10，將MCMC（Markov Chain Monte Carlo）開始時的不作數迭代（length of burn-in period）設為100 000次，再將不作數迭代后的MCMC設為100 000次，迭代次數（number of iterations）設置為5，依據似然值最大原則，選取合適的K值為群體數目，并繪出基于模型的群體遺傳結構圖。采用Tassel 2.1 軟件GLM（general linear model）和MLM（mixed linear model）2種模型程序，進行分子標記數據和表型數據的關聯分析。

2 結果

2.1 供試材料對干旱脅迫的響應分析

對供試材料考察了18個性狀，包括總葉片數、萎焉葉片數、生物量、單株蒴果數、單株產量、株高等，處理與對照間存在明顯差異，各項指標平均值均小于對照，表明各個材料均受到干旱脅迫的影響。干旱脅迫下，18個性狀值的變異系數在0.07—0.65，平均為0.31，對照的變異系數在0.06—0.40，平均為0.19，除株高外，其他性狀干旱脅迫的變異系數均大于對照。處理與對照間各性狀指標經配對t檢驗，均為極顯著，表明干旱處理對各性狀產生了明顯的抑制作用（表1）。處理組與對照組相比18個性狀的平均抗旱系數在0.326—0.951，均小于1.000，也表明測定的各項指標均受到干旱脅迫不同程度的影響（表2）。以上結果表明，研究材料間和調查的18個性狀均受到干旱脅迫，對干旱脅迫的響應存在明顯差異。

2.2 各項指標抗旱性綜合評價

參照連續變數的次數分布統計方法，將供試材料18個性狀的抗旱系數以組距為0.2分成7個組區間，制作成次數分布表（表3）。結果表明，在同一組區間各性狀的抗旱系數分布次數相差較大，其中，第1次復水前總葉片數、第2次復水前總葉片數、千粒重這三個指標的抗旱系數在0.9＜Xj≤1.1區間的分布頻率分別為82%、50%和53%，表明這三個性狀對干旱脅迫反應遲鈍；而第1次復水前萎蔫葉片數、第2次復水前萎蔫葉片數、第2次復水后萎蔫葉片數、第3次復水前總葉片數、第3次復水前萎蔫葉片數、第3次復水后萎蔫葉片數、地上部鮮重、地上部干重、成熟期株高、單株產量這10個指標的抗旱系數在Xj＜0.9區間分布頻率分別為92%、77%、67%、86%、100%、83%、62%、60%、68%和62%，表明這10個性狀對干旱脅迫的反應較敏感。由抗旱系數相關系數矩陣可看出（表4），各單項指標間存在一定的相關性，說明芝麻抗旱性是一個復雜性狀。

表1 各性測定值的差異分析Table 1 Variance analysis of mred value between characters

表2 各單指標的抗旱系數Table 2 Drought resistance coefficients of single index

續表2 Continued table 2

續表2 Continued table 2

續表2 Continued table 2

表3 供試材料各性狀指標的抗旱系數在不同區間的分布Table 3 Different distributions of drought-resistance coefficients of tested materials traits indexes

對干旱較敏感的10個性狀抗旱系數進行主成分分析，結果表明，前5個因子的累積貢獻率達到82%，因而取前5個因子，將以上10個性狀轉換為5個新的獨立的綜合指標，分別用CI（1）、CI（2）、CI（3）、CI（4）、CI（5）表示。第一主成分中第2次復水前萎蔫葉片數、第3次復水后萎蔫葉片數有較強的載荷量；第二主成分中地上部干重有較強的載荷量；第三主成分中，第1次復水前萎蔫葉片數、第3次復水前總葉片數、單株產量有較強的載荷量；第四主成分中，地上部鮮重、株高有較強的載荷量；第五主成分中，第2次復水后萎蔫葉片數、第3次復水前萎蔫葉片數有較強的載荷量（表5）。

根據公式（2）、（3）、（4）求得供試材料抗旱性綜合評價D值（表2）。根據D值大小對供試材料進行抗旱性排序，篩選出12份高抗旱芝麻種質資源（D值＞0.65），占供試材料的12%，其中，包括柳林芝麻3號、吳堡縣岔上鄉步墕村芝麻、g80、8602-2、柳林芝麻1號、臨縣芝麻2號、臨縣芝麻5號、g62、g45、吳堡縣岔上鄉郭家墕村芝麻、2012-48-01、四棱芝麻。

2.3 關聯分析

基于芝麻基因組開發多態性較好的33個SSR標記在100份芝麻供試材料中共檢測到170個等位變異，平均每個標記5.15個。利用structure數學模型對供試群體進行遺傳結構分析，由此判斷供試群體可被分為2個亞群，并繪制供試材料群體結構圖（圖1）。

利用GLM模型檢測到120個位點與以上對干旱脅迫響應敏感的10個性狀顯著關聯（P＜0.05），每個性狀的位點數在4—31個，變異解釋率為3.85%—14.30%（表6），有28個位點同時與2個或多個性狀關聯；位點2177-3關聯的頻次最高，同時與5個指標顯著關聯，分別為第1次復水前萎蔫葉片數、第2、3次復水前、后萎蔫葉片數，解釋率為6.43%—12.76%，其中第2次復水前萎蔫葉片數、第3次復水后萎蔫葉片數均屬于第一主成分中的因子；解釋率大于10%的標記位點有12個，其中1816-2、1664-3、1550-5、2177-3、1816-4、4033-3等6個位點與2個第一主成分因子（第2次復水前萎蔫葉片數和第3次復水后萎蔫葉片數）顯著關聯，4033-3是所有位點中變異解釋率最高的，對第2次復水前萎蔫葉片數解釋率達14.30%。

表4 各指標抗旱系數的相關系數矩陣Table 4 Correlation coefficient matrix between drought resistance indexes

表5 主成分載荷矩陣及貢獻率Table 5 Component matrix and contribution rate

圖1 基于SSR標記的100份芝麻種質遺傳結構Fig. 1 Population structure of 100 sesame materials based on SSR marker

利用MLM模型檢測到63個與10個性狀顯著關聯（P＜0.05），每個性狀的位點數分別在3—11個，變異解釋率為4.00%—12.50%，有13個位點同時與2個或多個性狀關聯；位點1816-3同時與4個指標顯著關聯，分別為第1、2次復水前萎蔫葉片數和第2、3次復水后萎蔫葉片數，解釋率為4.32%—6.32%，其中第2次復水前萎蔫葉片數、第3次復水后萎蔫葉片數均屬于第一主成分中的因子；解釋率大于10%的標記位點有3個，分別是2209-7、1935-6和4033-2，其中，變異解釋率最高的位點4033-2所關聯的性狀也為第2次復水前萎蔫葉片數，解釋率達12.5%。

利用2種模型均能檢測到的標記位點有5個，其中位點4033-6、1664-1同時與第1次復水前萎蔫葉片數顯著關聯，解釋率分別為4.46%—5.88%和4.07%—4.64%，該指標屬于第三主成分中的因子；位點2218-1與第2次復水后萎蔫葉片數關聯顯著，解釋率為9.9%—13.66%，該指標屬于第五主成分中的因子；位點1550-3同時與地上部鮮重、地上部干重顯著關聯，解釋率分別為5.36%—6.08%和4.09%—7.88%，這兩個指標分別屬于第四、二主成分中的因子。

表6 與抗旱性顯著相關（P＜0.05）的標記位點數和變異解釋率Table 6 Number of loci associated with drought resistance（P＜0.05）and phenotypic variation explanation rates

對第一主成分因子性狀關聯到的位點進一步分析，其中貢獻率較大且重復率高的標記位點主要有：4033-2和4033-3對第2次復水前萎蔫葉片數變異解釋率分別為12.5%和14.3%，2177-3對第2次復水前萎蔫葉片數、第3次復水后萎蔫葉片數變異解釋率分別為11.86%和12.21%，1816-2和1826-4對第3次復水后萎蔫葉片數變異解釋率分別為10.44%和13.99%，這些標記位點分別來自4033、2177和1816 3個引物，通過比對這三個引物序列在芝麻基因組上的位置，結果表明，4033位于LG4的1 981 965 bp附近，2177位于LG6的11 802 028 bp附近，1816位于LG11的10 438 634 bp附近，推測以上3個基因組區段可能存在芝麻抗旱性相關基因。

3 討論

近年來，中國國內外對芝麻抗旱性研究多局限于大田干旱脅迫和利用PEG模擬干旱對芝麻種子芽期進行抗旱性鑒定，本研究對芝麻成株期進行反復干旱試驗，綜合利用與抗旱響應關系密切的多項指標進行芝麻抗旱性綜合評價，為芝麻抗旱性精準鑒定提供了方法參考和理論基礎。截至目前，國內外對芝麻抗旱性研究的供試材料數量和指標數均少于本研究。KADKHODAIE等[28]評價了10份芝麻品種在不同土壤水分條件下的抗旱性差異；孫建等[19]對5個芝麻品種進行苗期干旱脅迫研究，測定指標均少于10個。本研究對100份芝麻資源測定了18個相關表型性狀，其中，總葉片數和萎蔫葉片數屬首次采用。采用連續變數的次數分布統計方法對供試材料進行分析發現，千粒重對干旱脅迫反應較遲鈍，這與孫建等[19]等的研究結果不一致，而與祁旭升等[25]在胡麻抗旱性研究所得結果相一致；利用綜合分析方法得到第2次復水前萎蔫葉片數和第3次復水后萎蔫葉片數2個與抗旱響應最為密切，為芝麻抗旱鑒定提供了可靠的新的指標。

植物的抗旱性是受多因素影響的、且非常復雜的數量性狀，不同指標的選擇不同，研究得到的結論也不一樣。因此，單一指標或少數指標的簡單分析很難且可靠地反應不同資源品種的抗旱性。近年來，雖然國內外學者針對不同作物從不同角度研究和提出了更加全面的抗旱評價鑒定方法[29-30]，然而現今對抗旱性鑒定評價的指標和方法均沒有準確可靠的統一規定，因此，建立科學的抗旱性綜合評價方法是芝麻抗旱性鑒定的基礎。目前普遍認為多指標多方法相結合的抗旱性綜合評價比較可靠[31]，朱宗河等[32]對油菜抗旱性的研究表明，利用隸屬函數等分析對甘藍型油菜耐旱性進行綜合評價，可篩選甘藍型油菜耐旱種質。因此，本研究采用綜合評價方法，可以較好地揭示各指標與抗旱性的關系，這樣既考慮了各指標間的相互關系，又考慮到各指標的重要性。該方法已在大豆[33]、小麥[34]等作物上應用，取得了比較理想的結果。不僅可以縮短芝麻抗旱性鑒定周期，同時為下一步研究耐旱分子機制提供理論依據。

芝麻的抗旱性是復雜的數量性狀，關聯分析是研究復雜數量性狀的有效方法，國內外在芝麻抗旱分子基礎研究方面，僅見黎冬華等[22]采用PEG 6000脅迫發芽芝麻種子基于SSR、SRAP和AFLP分子標記的關聯分析研究報道，利用GLM模型獲得2個解釋率（4.965%和4.18%）較高的SRAP標記和1個解釋率（4.38%）較高SSR標記。本研究對芝麻成株期進行抗旱鑒定，利用全基因組開發的33個多態性SSR標記與抗旱相關性狀進行關聯分析，利用GLM和MLM 2種模型分別檢測出120個和63個與抗旱性有顯著關聯（P＜0.05）的分子標記位點，變異解釋率分別為3.85%—14.30%和4.00%—12.5%，其中，2種模型均檢測到與第一主成分因子第2次復水前萎蔫葉片數顯著關聯的標記位點，且變異解釋率均為最高，分別達14.3%（位點4033-3）和12.5%（位點4033-2），通過比對4033引物序列在芝麻基因組上的位置，進一步發現基因SIN_1006195在其附近，該基因屬于已報道與抗旱緊密相關的NAC基因家族，可以作為芝麻抗旱后續研究的候選基因之一。研究結果為芝麻抗旱功能分子標記開發和抗旱基因發掘奠定了重要基礎。

本研究通過綜合評價，還篩選出一批高抗旱種質材料，為抗旱育種研究提供了關鍵材料。

4 結論

采用抗旱系數進行綜合評價，獲得柳林芝麻3號、g80、8602-2等高抗旱芝麻種質12份，可用于抗旱性育種；利用GLM和MLM 2個模型均檢測到與第一主成分因子第2次復水前萎蔫葉片數顯著關聯且變異解釋率最高的標記位點（位點4033-3和位點4033-2），此標記可應用于分子標記輔助選擇。

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（責任編輯 李莉）

Drought Resistance of Sesame Germplasm Resources and Association Analysis at Adult Stage

LIU WenPing1, Lü Wei1, LI DongHua2, REN GuoXiang1, ZHANG YanXin2, WEN Fei1, HAN JunMei1, ZHANG XiuRong2
(1Institute of Economic Crops Research, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031;2Institute of Oil Crops Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062)

【Objective】By association mapping between 33 SSR markers and 18 sesame drought-resistance phenotypes, identifying the associated loci, providing a basis for drought-resistance gene mapping and functional marker development, identifying drought-resistant sesame germplasm resources and providing parental materials and varieties for drought-resistance breeding.【Method】Sesame germplasm populations were cultivated using pots and stressed by drought-water-drought duplication treatment, morphology and growth index during the drought-stress period and mature period were analyzed, then the combinationmethod of SAS, SPSS, and membership function were used for drought-resistance evaluation. At the same time, association analysis was carried out using GLM and MLM models based on molecular markers and drought-resistance phenotype data.【Result】After drought stress, obviously different responses were observed among materials in the population, each index that related to drought resistance averaged smaller than the control; the averaged coefficient of variation of 18 traits was 0.31, which was higher than the control. T test of all traits between treatment and control showed a significant difference. A total of 10 indices related to drought-resistance were screened out, and 12 germplasms with high drought-resistance were identified by functional and clustering analysis. A total of 170 loci were detected by 33 SSR makers in the tested materials, the average loci number was 5.15 per marker. Genetic structure analysis indicated that the population consists of 2 sub-groups. There were 120 loci and 63 loci that were detected by association analysis based on GLM model and MLM model, respectively, the explanation rate ranged from 3.85% to 14.3%, and from 4.00% to 12.5%. There were 12 loci and 3 loci were detected with higher explanation rate than 10% by GLM and MLM, respectively, 5 loci were detected simultaneously by GLM and MLM. By comparison of the primers sequences with sesame genome, 3 genome regions were presumed located genes related with drought-resistance.【Conclusion】This research selected 12 sesame germplasms with high drought-resistance by comprehensive evaluation method, at the same time, 4033-3 and 4033-2 loci that were detected with the highest explanation rate by association analysis based on GLM model and MLM model, respectively, and the explanation rate were 14.3% and 12.5%.

sesame germplasm; drought resistance; SSR markers; association analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2017.04.003

2016-08-25；接受日期：2016-10-24

國家現代農業芝麻產業技術體系（CARS-15）、山西省科技攻關項目（20140311010-3）、山西省農業科學院科技自主創新能力提升工程項目（2016zzcx-07）、芝麻高產、優質、抗逆新品種選育（16 yzgc 009）

聯系方式：劉文萍，Tel：13593405471；E-mail：wenggeping@163.com