美洲大蠊醇提物對大鼠抗氧化應激的影響

隋世燕， 葛亞男， 徐取尉， 蘇晶晶

(大理大學農學與生物科學學院，云南大理671003)

美洲大蠊醇提物對大鼠抗氧化應激的影響

隋世燕， 葛亞男， 徐取尉， 蘇晶晶

(大理大學農學與生物科學學院，云南大理671003)

目的 研究美洲大蠊Periplanetaamericana醇提物對大鼠血清和卵巢抗氧化指標的影響。方法 17只成年雌性SD大鼠適應飼養7 d后，隨機分為3組：對照組(9 mL·kg-1，生理鹽水)5只、低劑量組(9 mL·kg-1，0.03 g·mL-1美洲大蠊醇提物)6只、高劑量組(9 mL·kg-1，0.09 g·mL-1美洲大蠊醇提物)6只。每2天灌胃1次，共飼養30 d。實驗結束后，采集大鼠血清和卵巢，檢測血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)指標和卵巢中SOD、GSH-PX、CAT基因表達的變化。結果 與對照組相比，高劑量組(P=0.085)、低劑量組(P=0.091)血清中的NO含量均有降低的趨勢；高劑量和低劑量的美洲大蠊醇提物均顯著提高了大鼠血清中的SOD含量(P<0.05)，同時，高劑量組血清中的MDA含量顯著降低(P<0.05)；此外，高劑量組和低劑量組卵巢SOD基因的表達顯著升高(P<0.05)。結論 美洲大蠊醇提物升高了大鼠血清SOD的含量，降低了NO和MDA的含量，同時，還提高了卵巢SOD基因的表達，說明美洲大蠊醇提物對大鼠卵巢具有一定的抗氧化應激功能。

美洲大蠊醇提物；氧化應激；基因表達；血清；卵巢；大鼠

氧化應激是在機體內環境穩態時，體內生成的活性氧超過機體的抗氧化防御能力時對細胞組織造成損害的病理性生物化學反應。氧化應激的本質在于反應性的氧化物與生物抗氧化劑間平衡的破壞，從而造成活性氧(reactive oxygen species，ROS)濃度升高。生理水平的ROS有助于卵子發生和卵泡形成，但是過量ROS對女性生殖健康則有許多不利的影響(Aitken & Koppers，2011)，可以破壞細胞的DNA、脂類和蛋白質，引起細胞基因、結構及功能受損，甚至導致細胞死亡(Bausenweinetal.，2010)。很多研究已經證實，卵泡內含有內源性抗氧化物酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等，與非酶類抗氧化物共同對抗氧化損傷以降低卵泡中的ROS水平(Agarwaletal.，2005；Goudetal.，2008)；但當卵母細胞中的氧化應激產物超過機體抗氧化能力時，就會引起多種卵巢相關疾病，如內分泌紊亂、卵泡閉鎖、卵巢早衰等，嚴重危害人類和動物的生殖健康(Agarwaletal.，2003，2005；Rizzoetal.，2012)。在人類輔助的生殖領域，氧化應激可引起體外胚胎老化、發育受阻、凋亡和碎片等(Sikka，2001；Agarwaletal.，2005；Rivaetal.，2007)。因此，減少卵巢氧化應激的發生，對提高卵母細胞質量、促進胚胎的發育有積極作用。

機體中常見的氧化應激標志物有以一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)為代表的脂質氧化產物(Wathesetal.，2007)，它們能反映生物體內脂質過氧化反應的程度。利用機體內源的抗氧化體系在細胞內部協同對抗自由基，最終有效消除細胞內過量的自由基。若想有效降低自由基對人體的危害，不僅要依靠內源性防御體系，還要利用外源性自由基清除劑，使自由基在侵入機體之前就被阻斷，避免機體遭受氧化損害(Bagchietal.，1997)。

美洲大蠊Periplanetaamericana屬于蜚蠊科Blattidae大蠊屬Periplaneta，原產于南美洲，食性廣泛，喜食糖和淀粉，污染食物、傳播病菌和寄生蟲，是世界性衛生害蟲，其分泌物和糞便還含有致癌物質，但其藥理作用卻日益造福人類，其具有抗肝炎、抗腫瘤、抗菌、抗人類免疫缺陷病毒、增強機體免疫力、消炎鎮痛、促進血管增生和組織修復等作用(戴云等，2005；何正春等，2009)。研究發現，美洲大蠊提取物在體外具有一定的抗氧化能力(焦春香等，2011)，但是，其在體內的抗氧化效果卻未見報道。

因此，本研究以成年SD大鼠為研究對象，觀察以美洲大蠊醇提物干預后其血清NO、GSH-PX、CAT、SOD和MDA等氧化或抗氧化應激指標的變化，并且測定了大鼠卵巢中抗氧化相關基因GSH-PX、CAT和SOD的表達，以探討美洲大蠊醇提物對大鼠機體和卵巢的抗氧化能力，從而為研究美洲大蠊醇提物對動物繁殖功能的影響奠定基礎。

1 材料

1.1 實驗對象

1.1.1 實驗動物 17只成年SD雌性大鼠，體質量230～250 g，購自第三軍醫大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(渝)2007-017，實驗動物使用許可證號：SCXX(滇)2005-0010。

1.1.2 美洲大蠊醇提物的制取 成年美洲大蠊(由大理大學昆蟲生物醫藥研究院贈送)處死后，晾干，將蟲體粉碎，用15倍量的95%乙醇進行冷浸提取3次，然后去除脂肪，沉淀物放入-40 ℃保存備用。

1.1.3 實驗處理 大鼠先進行7 d的自由采食飼養，以調節生理周期，使其適應環境。按體質量隨機分為3組，對照組5只灌胃生理鹽水；低劑量組6只灌胃低劑量的美洲大蠊醇提物(0.03 g·mL-1)；高劑量組6只灌胃高劑量的美洲大蠊醇提物(0.09 g·mL-1)；根據甘平等(2011)的方法，3組大鼠灌胃的劑量均為每千克體質量9 mL。所有大鼠均自由飲水和采食。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 NO試劑盒、CAT試劑盒、MDA試劑盒、GSH-PX試劑盒、SOD試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Trizol試劑盒購自上海Life Technologies生物技術有限公司；DNA酶購自TaKaRa公司；反轉錄酶購自Promega公司；dNTP和RNA酶抑制劑購自南京生興生物工程有限公司；含SYBR GREEN的DNA聚合酶購自TaKaRa公司。10%水合氯醛。反轉錄引物、內參引物和基因表達引物由上海捷瑞生物技術有限公司合成。

1.2.2 主要儀器 可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；NanoDrop分光光度計(ND-1000)，美國Thermo公司；普通PCR儀(Gene Amp PCR system 9600)，美國Perkins Elmer公司；實時熒光定量PCR儀(Mx3000P)，美國Stratagene公司。

2 方法

2.1 動物模型建立

大鼠自由取食喂養7 d后灌胃，每2天1次。

2.2 樣本采集

大鼠喂養30 d后開始采樣，用10%水合氯醛(每千克體質量2 mL)對大鼠進行腹腔注射，待麻醉后剖開腹腔，腹主動脈采血，將血注入含有EDTA-Na的抗凝管里，將卵巢放入EP管中，置于-70 ℃保存。血液4000 r·min-1離心10 min，取上清。

2.3 血清中各氧化和抗氧化應激指標測定

根據說明書進行NO、GSH-PX、CAT、SOD、MDA指標的測定。

2.4 基因表達測定方法

2.4.1 RNA提取及質量控制 根據說明書，使用Trizol試劑盒提取卵巢總RNA，DNA酶處理后用NanoDrop分光光度計測定總RNA的濃度，測得的值應在2 000 ng·μL-1內，若超過則稀釋后重測，OD260/280=1.8～2.2。最后取5 μg RNA稀釋到500 ng·μL-1，每管4 μL，共分裝2套，用于RNA反轉錄。

2.4.2 反轉錄 反應總體積25 μL。第一步，2 μg總RNA，10 mmol·L-1dNTP，2.5 μmol·L-1隨機引物，加DEPC水至10 μL，在普通PCR儀上70 ℃變性5 min后，立即置于冰上冷卻；第二步，加5 μL5×RT buffer，0.2 μL 1 000 U RNA酶抑制劑，0.1 μL 10 000 U反轉錄酶(M-MLV)，DEPC水補齊至25 μL，在普通PCR儀上37 ℃反應1 h，95 ℃活化5 min。反轉錄產物短期內使用可置于4 ℃，長期保存需置于-20 ℃。

2.4.3 引物設計 內參基因GAPDH和目的基因的引物根據GenBank上豬的相關cDNA序列，采用Primer premier 5.0進行設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

2.4.4 PCR擴增反應 將cDNA原液稀釋至10%，使用實時熒光定量PCR儀檢測目的基因的mRNA表達，其體系為：cDNA 2 μL，1 μmol·L-1目的或內參基因引物2 μL，高壓ddH2O 6 μL，含SYBR Green的DNA聚合酶10 μL，共20 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個循環。

統計方法使用2-ΔΔCt法(Livak & Schmittgen，2001)。計算公式如下：△△Ct=(CtTarget-CtGAPDH)x-(CtTarget-CtGAPDH)control。

其中，以對照組的目的基因CtTarget和內參基因CtGAPDH差值的平均值為對照進行計算，x表示任意一個樣本，通過上述公式計算出每一個樣本目的基因的表達，即通過GAPDH校正后相對于對照組的目的基因表達的倍數。

表1 基因表達引物序列Table 1 The primer sequences of gene expression

2.5 數據統計與分析

所有數據用平均值±標準誤(Mean±SE)表示，統計分析采用SPSS 17.0中的單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 美洲大蠊醇提物對血清中各氧化和抗氧化應激指標的影響

3.1.1 對NO、GSH-PX和CAT含量的影響 與對照組相比，低劑量組(P=0.085)和高劑量組(P=0.091)均使大鼠血清中NO含量有減少的趨勢。與對照組相比，高劑量和低劑量的美洲大蠊醇提物均沒有顯著影響大鼠血清中的GSH-PX和CAT含量(P>0.05)。

3.1.2 對SOD含量的影響 與對照組相比，高劑量和低劑量的美洲大蠊醇提物均顯著增加了大鼠血清中的SOD含量(P<0.05)(圖1)。

圖1 雌性SD大鼠血清中SOD含量的測定

3.1.3 對MDA含量的影響 與對照組相比，低劑量的美洲大蠊醇提物沒有顯著影響大鼠血清中的MDA含量，但高劑量能夠顯著降低大鼠血清中的MDA含量(P<0.05)(圖2)。

圖2 雌性SD大鼠血清中MDA含量的測定

3.2 美洲大蠊醇提物對卵巢中抗氧化應激相關基因表達的影響

3.2.1 對GSH-PX和CAT基因表達的影響 與對照組相比，高劑量與低劑量的美洲大蠊醇提物均沒有顯著影響大鼠卵巢GSH-PX和CAT基因的表達(P>0.05)。

3.2.2 對SOD基因表達的影響 由圖3可知，與對照組相比，高劑量和低劑量的美洲大蠊醇提物均顯著增加了雌性大鼠卵巢中SOD基因的表達(P<0.05)。

圖3 雌性SD大鼠卵巢組織中SOD基因的表達

4 討論

本實驗結果顯示，不同劑量的美洲大蠊醇提物能夠降低大鼠血清中氧化應激指標NO及MDA的含量，并且能夠增加大鼠血清中SOD的含量及其基因表達，說明美洲大蠊醇提物對大鼠機體和卵巢具有一定的抗氧化應激功能。

美洲大蠊醇提物使大鼠血清中MDA及NO的含量減少，顯示了體內抗氧化酶防御系統能力的增強，使機體清除自由基的能力加強，從而使過多的自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸而產生的MDA的含量也得到了控制，細胞膜不再受到過多自由基的侵襲，保證了其正常的組織形態和完整的功能，說明美洲大蠊醇提物具有增強抗氧化能力的功能。增強對NO及MDA的抑制作用，提高SOD的含量和基因表達，可能是美洲大蠊醇提物對機體抗氧化功能的保護機理所在。這與鄒俊波等(2016)的研究相似，美洲大蠊醇提物能夠顯著降低乙醇致急性胃潰瘍小鼠胃黏膜組織內MDA和NO的水平，提高CAT、SOD和GSH-PX的活性，進而預防急性胃潰瘍。

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Influence ofPeriplanetaamericanaExtract on Antioxidant Stress in Rats

SUI Shiyan， GE Yanan， XU Quwei， SU Jingjing

(College of Agronomy and Bioscience， Dali University， Dali， Yunnan Province 671003， China)

Objective To study the effect ofPeriplanetaamericanaalcohol extract on antioxidant index of serum and ovary in rats. Methods A total of 17 adult female SD rats were randomly assigned to 3 groups after a week of adaption in the laboratorial environment. The rats of control group (n=5) were fed with physiological saline (9 mL·kg-1) through stomach perfusion. The rats of experimental groups (6 per group) were treated with low-dose (9 mL·kg-1， 0.03 g·mL-1) and high-dose (9 mL·kg-1， 0.09 g·mL-1)P.americanaalcohol extract as described above. Rats were treated every other day for 30 days. Subsequently， the serum and ovaries of rats were collected， and the levels of malondialdehyde (MDA)， superoxide dismutase (SOD)， catalase (CAT)， nitric oxide (NO)， glutathione (GSH-PX) in the serum， the expression of geneSOD，GSH-PXandCATin the ovary were detected. Results Compared with control group， the NO content in rats serums of high-dose group (P=0.085) and low-dose group (P=0.091) showed a decreasing trend but not significant; the content of SOD in rats serums were significantly increased (P<0.05). Moreover， the content of MDA in rats serums were significantly decreased in the high-dose group (P<0.05). In addition，P.americanaalcohol extract treatment significantly increased the expression ofSODgene in ovary (P<0.05). ConclusionP.americanaalcohol extract can significantly increase the content of antioxidant index SOD and reduce levels of the oxidative stress indicators NO and MDA， and can also significantly increase the expression ofSODgene in ovary. Therefore，P.americanaalcohol extract has a certain antioxidant stress function to the ovary of rats.

Periplanetaamericanaalcohol extract; oxidative stress; gene expression; serum; ovary; rats

2016-10-14 接受日期：2016-12-15

云南省教育廳項目(2014C110Y); 大理大學博士科研啟動基金項目(KYBS201406)

隋世燕(1981—)， 男， 博士， 講師， 主要從事動物營養與繁殖方面的研究， E-mail：sysui569@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160279

Q95-33

A

1000-7083(2017)02-0198-05