食源性致病菌液相芯片高通量快速檢測技術(shù)的應(yīng)用進展

黨亞麗，周亭屹，么春艷，俞盈

（浙江省醫(yī)學科學院，浙江杭州310013）

食源性致病菌液相芯片高通量快速檢測技術(shù)的應(yīng)用進展

黨亞麗，周亭屹，么春艷，俞盈

（浙江省醫(yī)學科學院，浙江杭州310013）

近年來，食源性疾病已成為當前世界上最突出、最廣泛的食品安全問題，致病菌可導致食源性疾病的發(fā)生，然而現(xiàn)行的致病菌檢測手段已不能滿足快速、準確、高通量等要求。液相芯片技術(shù)是基于流式細胞技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和傳統(tǒng)芯片技術(shù)等開發(fā)的新一代生物芯片技術(shù)和新型蛋白質(zhì)研究平臺，能同時檢測多種致病菌。首先對液相芯片的技術(shù)原理、特點等進行了簡單介紹，接著重點對該技術(shù)在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用情況進行了總結(jié)，同時指出了其在食源性致病菌檢測過程中可能出現(xiàn)的問題，最后對該技術(shù)的應(yīng)用前景進行了展望，對有效控制食物中毒事件的發(fā)生、食品安全控制、海關(guān)進出口檢驗檢疫、臨床診斷等具有重要指導意義。

液相芯片；食源性致病菌；檢測；應(yīng)用

近年來，隨著社會經(jīng)濟及人民健康水平的發(fā)展，食品安全問題越來越受到人們的普遍關(guān)注，由病原微生物引起的食源性疾病是目前世界范圍內(nèi)最突出、最廣泛的食品安全問題，是影響食品安全的最重要的因素之一[1]。近幾年，我國衛(wèi)生部門通過突發(fā)公共衛(wèi)生事件網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)收到的食物中毒事件中，微生物性食物中毒事件人數(shù)最多，其中大部分是細菌引起的食物中毒，如沙門氏菌、蠟樣芽胞桿菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌等。由食源性污染產(chǎn)生的疾病已成為目前危害人們健康的最主要因素之一，開展食源性致病菌的快速檢測研究意義重大。

目前，可用于檢測和鑒定食源性致病菌的方法主要有傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法以及一些分子生物學和免疫學方法，如聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法由于操作繁瑣、檢測時間長、靈敏度低等原因已被替代。ELISA的檢測結(jié)果易受多種因素影響，且易出現(xiàn)假陽性。PCR法雖然檢測速度快，但檢測通量低、操作繁瑣[2]。目前較常用的PCR以及ELISA法在實際檢測中由于致病菌的種類繁多，進行檢測時需多次試驗，費時費力。隨著現(xiàn)代食品加工和運輸速度的加快，對食源性致病菌的檢測手段要求快速、靈敏，上述方法已不能滿足這些要求。要判斷食品中的主要致病菌或?qū)Χ鄠€食品樣本進行同時檢測，仍需一種能同時快速檢測多種致病菌的方法。有學者研究表明，發(fā)展一種能快速準確檢測病原體的方法可顯著提升食品安全[3]。因此，一種快速、準確檢測和追蹤病原體和污染物的來源的方法成為當前迫切發(fā)展所急需[4]。

20世紀90年代以來分子生物學研究發(fā)展迅猛，且多學科融合發(fā)展。生物芯片技術(shù)是融微電子、生物學、物理學、化學、計算機為一體的尖端新技術(shù)，是影響最深遠的重大科技進展之一。它通過微加工技術(shù)將大量的生物捕獲分子（如核酸探針、抗體、抗原等）高密度地排列在特定的載體上，利用生物分子間的特異性親和反應(yīng)，實現(xiàn)對基因、配體、抗原等生物活性物質(zhì)的檢測分析，從而達到一次試驗同時檢測多種疾病或分析多種生物成分的目的。

1 液相芯片技術(shù)簡介

液相芯片（1iquichip）是美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，是基于xMAP（flexible Multi-Analyte Profiling）技術(shù)開發(fā)的多功能新型生物芯片技術(shù)平臺，也稱懸浮陣列、微球體懸浮芯片（suspension array，liquid chip）[5-6]。xMAP技術(shù)將芯片技術(shù)與流式檢測有機地結(jié)合在一起，集流式技術(shù)、熒光微球、激光、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)化學技術(shù)為一體，使生物芯片反應(yīng)體系由液相--固相反應(yīng)改為接近生物系統(tǒng)內(nèi)部環(huán)境的完全液相反應(yīng)體系，實現(xiàn)了高通量檢測。xMAP技術(shù)是相對靈活、開放，根據(jù)待檢測生物分子和不同需要進行相應(yīng)的構(gòu)建，從而能快速、準確、經(jīng)濟的檢測生物分子，被廣泛用于制藥開發(fā)、臨床診斷和生物研究。

近年來Luminex公司于1999年研制出第一代Luminex 100液相芯片檢測系統(tǒng)，它可同時對1個樣本中的100種不同目的分子進行檢測。Luminex 200液相芯片檢測系統(tǒng)已于2005年研制出，它可根據(jù)需要調(diào)節(jié)探針高度，增強了檢測準確性。2007年研制的新一代液相芯片檢測平臺Flexmap 3D可同時對一個樣本中的500種不同目的分子進行檢測，且可一次檢測384個不同樣本。xMAP技術(shù)的不斷更新使其與傳統(tǒng)檢驗方法相比優(yōu)點更多，應(yīng)用范圍也更加廣泛。

液相芯片技術(shù)用熒光染色的方法編碼聚苯乙烯微球（微球直徑一般為5.6 μm），每種熒光微球均有一個獨特的編號。傳統(tǒng)的Luminex 100/200技術(shù)在微球中加入2種不同熒光素，根據(jù)熒光素的比例不同將微球分為100種[7]，而Flexmap 3D技術(shù)通過加入3種不同的熒光素，根據(jù)熒光素的比例不同可將微球分為500種。然后將每種顏色的微球（或稱為熒光編碼微球）表面進行不同的化學結(jié)構(gòu)修飾，在其表面上共價交聯(lián)針對特定檢測物的探針、抗原或抗體。將不同熒光信號的微球共價結(jié)合不同探針分子后懸浮于一個液相體系中，加入的抗原、抗體等待測物與其充分反應(yīng)。再在體系中加入標記有另一種熒光信號（一般為綠色）報告分子，這就構(gòu)成了一個液相芯片反應(yīng)系統(tǒng)。在檢測過程中，通過運用流式細胞技術(shù)和激光技術(shù)，使微球逐個通過特制通道進行檢測。檢測系統(tǒng)的激光發(fā)射器可以發(fā)射兩束不同波長的激光，紅色激光用于激發(fā)微球本身的熒光，用于鑒別微球的種類；另一束綠色激光激發(fā)報告分子結(jié)合的熒光，并通過檢測熒光的強度，用LuminexTM分析軟件對被測物進行定量分析[8]。

目前已有的微球主要有5種：MicroPlex微球、SeroMap微球、xTAG微球、LumAvidin微球和MagPlex微球，這些都是在MicroPlex微球的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的[9]。其中SeroMap微球是專門為血清學檢測所設(shè)計，可減少血清中不同抗體與微球的非特異結(jié)合降低背景值。xTAG微球?qū)в衪ag的核酸探針與MicroPlex微球連接，可用于核酸檢測。MagPlex微球是Luminex公司2007年推出的，又稱磁珠（magneticbeads），其最大的特點是帶有磁性，使得整個檢測過程可自動完成，大大提高了檢測速度[10]。

液相芯片技術(shù)的優(yōu)點包括：（1）檢測適用范圍廣：微球表面可包被蛋白、核酸及其他配受體，既能檢測蛋白，又能檢測核酸，很多生物分子都能用液相芯片進行分析；（2）檢測通量高：目前Flexmap 3D技術(shù)可對500種靶標分子進行檢測，而ELISA每次只能對1種分子進行單一分析；（3）檢測靈敏度高：反應(yīng)過程中微球在液相的條件下懸浮，增加了反應(yīng)面積，反應(yīng)時結(jié)合的目標分析物多，檢測靈敏度高[11-12]；（4）檢測速度快：由于微球直徑小，混懸于液體中，利于生物分子間的相互作用，從而提高了反應(yīng)速度，一次分析耗時不到3 h，工作效率高[13]；（5）特異性強：液相芯片技術(shù)具有很強的特異性；（6）靈活性好：可根據(jù)待檢目標分子調(diào)整檢測體系，選擇所需的探針微球系統(tǒng)，靈活性好；（7）檢測需要樣品量少：液相芯片檢測需要的樣品量較其他檢測手段更少；（8）操作簡單：液相芯片技術(shù)操作更省時、省力，很多步驟自動完成，減少了不同人之間操作的誤差。

目前液相芯片技術(shù)由于其高通量、良好的可重復性、高敏感度等特點被廣泛應(yīng)用于病原體檢測，遺傳性疾病的篩查，基因表達的分析，細胞因子的分析[14-15]。

2 液相芯片技術(shù)在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用

目前有研究人員將多重PCR和液相芯片技術(shù)有效地結(jié)合起來，能對多種常見食源性致病菌進行準確的定量檢測，且耗時較短（6 h～8 h）。該法對致病菌基因序列進行分析后設(shè)計針對這些基因的特異性探針和引物，分別與不同編號的熒光編碼微球偶聯(lián)后再與相應(yīng)的PCR產(chǎn)物雜交反應(yīng)，用液相芯片檢測儀檢測熒光信號，實現(xiàn)了對致病菌的檢測，如邱楊等[16]通過該法建立了對沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌的快速液相芯片檢測方法，檢測靈敏度達到50 copies/mL～100 copies/mL。郭啟新等[17]建立了對金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、志賀氏菌的檢測方法，具有很好的特異性，檢測靈敏度分別達38、44、21 CFU/mL。Sun等[18]用該法建立了高通量的同時檢測6種食源性致病菌的方法，檢測靈敏度達到了20.4×103CFU/mL，遠高于PCR法。

目前還有人用免疫磁珠分離技術(shù)將磁珠上包被的特異性抗體，利用抗原抗體之間親和反應(yīng)，從成分復雜的樣品中快速簡便分離目標抗原，再利用磁珠的磁響應(yīng)性，實現(xiàn)對目標抗原的富集，再結(jié)合最新的快速檢測技術(shù)，實現(xiàn)對食源性致病菌進行檢測。Taha等[19]將免疫磁珠分離技術(shù)結(jié)合科瑪嘉的顯色培養(yǎng)基檢測雞肉中的沙門菌，該法靈敏度達99%，檢測限高達1.6 CFU/mL。Cadirci等[20]利用免疫磁珠分離技術(shù)，從200個新鮮牛肉樣品和100個牛肉丸樣品中分離大腸桿菌0157：H7和0157，再結(jié)合多重PCR技術(shù)檢測毒力基因，達到了檢測致病菌和非致病菌的目的。

還有報道通過液相芯片技術(shù)對食品中真菌代謝產(chǎn)生的毒素進行定量檢測。宋慧君等[21]采用間接競爭法原理和液相芯片技術(shù)平臺，通過優(yōu)化偶聯(lián)抗原濃度，建立了黃曲霉毒素B1液相芯片定量檢測方法，靈敏度為2.33 ng/mL（0.116 5 ng）。

3 液相芯片技術(shù)在食源性致病菌檢測應(yīng)用中存在的問題

目前許多學者已將液相芯片技術(shù)與多重PCR技術(shù)結(jié)合使用，但基于多重PCR的液相芯片技術(shù)對單管樣本進行大量不同指標的高通量多重PCR方法建立仍存在困難，至今未見有關(guān)液相芯片用于檢測超過20種致病菌方法建立的相關(guān)報道。在多重PCR制備待檢模板過程中，易出現(xiàn)多引物不兼容、探針非特異性結(jié)合、交叉雜交、雜交陰性背景高等問題，且不同探針的雜交溫度和孵育時間等條件的優(yōu)化，以及避免不同雜交反應(yīng)之間的交叉反應(yīng)等過程節(jié)點多，且較繁瑣。這些問題限制了在單管中進行高通量的多重PCR，導致無法進行高通量液相芯片檢測[22]。

由于抗原靶標的選擇特異性要求高，且食源性致病菌的食品基質(zhì)復雜同樣也制約了液相芯片技術(shù)的發(fā)展。研究者用免疫磁珠對肉品中的致病菌進行分離富集，若不滿足高特異性的要求，則富集到很多雜菌，富集到的雜菌會抑制目標菌生長，有時甚至難以富集到致病菌。因此免疫磁珠分離技術(shù)若在食源性致病菌檢測領(lǐng)域有所發(fā)展，仍需進行大量研究工作，篩選到致病菌的特異性抗原靶標[23]。

4 展望

液相芯片技術(shù)是一個靈活的操作平臺，具有檢測準確、可重復性好、信息質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡便、耗時較短等優(yōu)點。目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于制藥開發(fā)、臨床診斷和生物研究等方面。在食品衛(wèi)生檢測中，常需對多樣品中多種致病菌進行快速檢測，將液相芯片技術(shù)應(yīng)用到食源性致病菌檢測中，可在短時間內(nèi)實現(xiàn)對多個樣品同時進行多種致病菌檢測，因而有望大大提高食源性致病菌檢測效率，在有效控制食物中毒事件的發(fā)生、食品安全控制、海關(guān)進出口檢驗檢疫、臨床診斷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Application Progress on the High-flux and Rapid Detection Technolgy of the Suspension Array for the Food Borne

DANG Ya-li，ZHOU Ting-yi，YAO Chun-yan，YU Ying
（Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013，Zhejiang，China）

In recent years，food borne disease has become the world's most outstanding and widely problems in food safety currently.Pathogens can lead to food borne disease.The existing detection methods for the pathogens which lead to food borne disease can not meet the requirements of the fast，accurate and the high flux.There is an urgent need to develop a rapid and accurate method to detect food borne pathogens.Firstly，the paper introduced the principle of the suspension array technology；secondly，the characteristic of the suspension array technology has been summarized；thirdly，it was focused on the application of this technology in the detection of food borne pathogens；at the same time the technical problems that may occur in the process of detection of food borne pathogens were pointed out；finally，the application of this technology was prospected；it had great impor－tance to control the occurrence of food poisoning effectively and the food safety，the customs import and export inspection and the clinical diagnosis，etc.

suspension array technology；food borne pathogens；detection；application

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.045

2016-07-22

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生項目（201473497）；浙江省科技廳重大科技專項項目（2014c02023）

黨亞麗（1978—），女（漢），副研究員，博士，研究方向：生物活性物質(zhì)及食品安全快速檢測。