有害甲藻Stoeckeriaalgicida在遼東灣的時空分布

宋 倫,劉衛東,吳 景,宋廣軍,宋永剛,孫 明,王年斌

遼寧省海洋水產科學研究院,遼寧省海洋生物資源與生態學重點實驗室, 大連 116023

有害甲藻Stoeckeriaalgicida在遼東灣的時空分布

宋 倫*,劉衛東,吳 景,宋廣軍,宋永剛,孫 明,王年斌

遼寧省海洋水產科學研究院,遼寧省海洋生物資源與生態學重點實驗室, 大連 116023

Stoeckeriaalgicida為甲藻綱胸甲球藻科,有侵噬魚類細胞殺魚的能力,可導致魚類成群死亡,同時也會殺死其他海洋微藻。由于該藻個體微小、形態學鑒定困難,研究較為遲緩,我國海域幾乎沒有該藻的研究報道。近幾年,高通量測序技術的發展極大地推動了微型/微微型浮游植物的鑒定研究,為了解我國遼東灣海域是否存在Stoeckeriaalgicida及其分布情況,以18S rDNA V4區作為目標基因,結合高通量測序技術,專門設計了微型/微微型浮游植物鑒定引物對V4(F/R),隨后對遼東灣2014年四季海水中微型和微微型浮游植物多樣性進行了檢測。結果發現,Stoeckeriaalgicida除了春季未檢出外,其他季節均有檢出,溫度是影響該藻繁殖的主要因素。雖然Stoeckeriaalgicida在整個環境樣品中優勢度不太明顯,但其夏季密度較高(最高達2.753×103個/L),高值區主要分布在遼東灣東西兩岸,致災風險較高,應引起有關方面足夠重視。Stoeckeriaalgicida在我國海域首次報道,其危害后果嚴峻,必須加強監測監管。

Stoeckeriaalgicida;胸甲球藻科;外來有害微藻;微型浮游植物;高通量測序;遼東灣

外來海洋生物入侵對生態系統穩定性的影響以及造成的經濟損失,已經引起科學界和社會公眾的廣泛關注。20世紀及21世紀初運輸船舶壓載水排放等導致外來海洋浮游生物廣泛傳播,曾多次引發有毒有害赤潮,對沿海養殖業、漁業資源、水產品質量、生態環境及人類健康都造成了巨大危害[1- 2]。船舶壓載水是海洋生物入侵的最重要途徑,其對海洋環境的侵害已被全球環境基金組織確認為與“陸源對海洋的污染”、“海洋生物資源掠奪性開發利用”、“海洋棲息環境的改變(破壞)”等共同構成危害海洋的四大威脅之一。因此,世界海事組織、聯合國發展計劃署和全球環境基金組織聯合提出了全球壓載水控制與管理公約,也開展了壓載水的處置技術研究,基于檢測技術的限制,主要是針對部分微型(粒徑為2—20 μm)和小型浮游植物(粒徑為20—200 μm)的檢測。微微型浮游植物(粒徑為0.22—2 μm)在海洋中多樣性相當豐富,也是褐潮暴發的主要致災種,由于微型藻類個體微小、形態學鑒定困難一度研究較為遲緩。

隨著分子生物學的快速發展,有關微型藻類多樣性的研究得到了快速發展。目前,已有學者對太平洋[3]、地中海[4]和印度洋[5]等各大海域的微型藻類分子多樣性進行了研究,相關的基因文庫也在不斷更新和擴充。我國在南海[6]、渤海[7]和北黃海[8]等海域對微型藻類的分子多樣性研究也在逐漸開展。近年來,新型海洋生態災害頻發,由微型藻類引發的褐潮在我國渤海海域頻繁暴發,對貝類養殖危害較大[9]。我國目前報道的褐潮致災種由抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)引發,但最新研究發現,在渤海可引發褐潮的微型藻類并非這一種[7]。近幾年高通量測序技術的發展極大地推動了微型藻類的高效檢測研究[10-12],該技術具有簡單快速、測序通量高、錯誤率低和成本低等特點,為微型藻類的高效檢測提供了新思路。

Stoeckeriaalgicida為甲藻綱胸甲球藻科,有侵噬魚類細胞殺魚的能力,可以導致魚類成群死亡,同時也會殺死其他海洋微藻,2004年首次在韓國慶南馬山海域被發現,我國目前尚未發現有該種的報道[13]。遼東灣為我國最北端半封閉內海,航運較為頻繁,加之富營養化嚴重,發生外來有害微藻入侵的風險較高,危害較大。本研究采用高通量測序平臺,結合生物信息學方法,以18SrDNA的V4區為目標基因對遼東灣海域的微型和微微型浮游植物進行了多樣性檢測,已發現外來有害微藻Stoeckeriaalgicida的擴散跡象,因此亟需了解其生態分布狀況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

為了解外來有害微藻Stoeckeriaalgicida的分布及擴散情況,在遼東灣海域網格化設置16個站位(圖1),分別于2014年5月(春)、8月(夏)、10月(秋)、12月(冬)采集表層海水1L,首先經20μm微孔濾膜過濾去除小型及大型浮游生物,然后經0.22μm微孔濾膜收集微型和微微型浮游生物,最后將濾膜轉移至1.5mL無菌離心管中,置于-20℃或-80℃冷凍保存、運輸。

圖1 采樣站位示意Fig.1 Sampling station locations

1.2 分析方法

1.2.1 基因組 DNA 的提取

采用CTAB法提取微型/微微型浮游植物宏基因組,將0.22 μm濾膜剪碎于1.5 mL離心管中,加入500 μL CTAB裂解液(2%CTAB;100 mmol/L Tris-Cl pH 8.0;1.4 mmol/L NaCl;10 mmol/L EDTA)和1 μL β-巰基乙醇,5—10 μL蛋白酶K,55℃裂解 1—1.5 h。短暫離心,取出液體于新的離心管中,用酚氯仿抽提2 次后,取上清,加入兩倍體積預冷的無水乙醇,沉淀2—3 h,保留沉淀,使用75%乙醇清洗沉淀,得到微藻宏基因組DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并利用紫外分光光度計測定DNA濃度及純度,-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 18S rDNA可變區V4的PCR擴增

本研究應用的引物為自行開發的微型/微微型浮游植物18S rDNA的V4區基因擴增引物對V4(F/R)。上游引物為V4-F序列5′-GCGGTAATTCCAGCTCCAATA- 3′,下游引物V4-R序列為5′-GATCCCCHWACTTTCGTTCTTGA- 3′。將引物連接適當的接頭送往上海生工生物公司進行合成。PCR反應體系為50 μL,包括PCR Buffer 5 μL、dNTP Mixture 8μL、上下游引物(10 μmol/L)各2 μL、模板DNA 2 μL、Taq DNA聚合酶2.5 U,加適量滅菌水。擴增反應均在PE 9700型PCR儀(美國PE公司)上完成,反應條件：94℃預變性3 min;94℃變性30 s,58 ℃退火45 s,72℃延伸45 s,共33個循環;72℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,將檢測合格產物交由諾和致源生物信息科技有限公司,使用NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs)建庫試劑盒進行文庫的構建,構建好的文庫經過Qubit定量和文庫檢測,合格后使用Hiseq2500 PE250進行上機測序。

1.2.3 數據分析

測序得到的原始數據使用FLASH軟件進行拼接,參照Qiime軟件質量控制流程將拼接后的序列經過截取、過濾得到有效數據。利用Uparse軟件對有效數據進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類,采用RDP Classifier方法與Silva數據庫對OUTs代表序列進行物種注釋,同時對物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。鏡檢同期水樣中出現的所有浮游植物,篩選各站位出現頻度最高的種類角毛藻屬(Chaetocerossp.)作為基準密度[14],通過OTUs比例,計算Stoeckeriaalgicida密度,相關公式如下：

(1)利用OTUs比例測算Stoeckeriaalgicida密度：

式中，NS為該站位Stoeckeriaalgicida密度(個/L),NC為同一站位水樣中所有角毛藻密度(個/L,鏡檢獲得),COTU為該站位水樣中所有角毛藻的OTUs數,SOTU為該站位Stoeckeriaalgicida的OTUs數。

(2)相對多度(RA)計算Stoeckeriaalgicida的季節比例：

式中,ni為i種的密度(個/L),N為統計單元的總密度(個/L)。

(3)物種優勢度(Y)表示微型/微微型浮游植物群落中某一物種在其中所占的優勢程度：

式中,nx為第x種微型/微微型浮游植物種類的OTUs數,N為OTUs總數,fx為第x種微型/微微型浮游植物種類在各樣品中出現的頻率。

2 結果

2.1 分子鑒定引物優化

為增加微型/微微型浮游植物檢測的高效性,對引物的進行了篩選優化。本文針對目前已發現的微型/微微型浮游植物并結合浮游植物歷史調查結果,設計了比較適合我國黃渤海海域的微型浮游植物分子鑒定特異引物。針對浮游植物18S rDNA V4區基因設計了引物對V4(F/R)(5′-GCGGTAATTCCAGCTCCAATA- 3′,5′-GATCCCCHWACTTTCGTTCTTGA- 3′),針對V9區基因選擇通用引物對V9(F/R)(5′-CCCTGCCHTTTGT ACACAC- 3′,5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC- 3′),并選擇Stoeck[15]等人設計的真核生物18S rDNA V4區擴增引物對C4(F/R)(5′-CCAGCASCYGCGGTAATTCC- 3′,5′-ACTTTCGTTCTTGATYRA- 3′)進行了比較分析。

V4(F/R)引物對的設計是從NCBI數據庫下載179(76條微型/微微型)條藻類18S rDNA序列(包含11個門、23個綱、179種),利用軟件MEGA4進行多重序列比對,找到對應的V4區,同時結合測序技術要求進行引物設計,片段長度為300—450bp,并使用DNAMAN、Oligo Calc等軟件對引物的基本參數進行檢測和評估。統計結果顯示,引物V4(F/R)對真菌、后生動物、領鞭毛蟲目類群的擴增特異性要低于V9(F/R)和C4(F/R),而對真核藻類的擴增特異性均高于V9(F/R),擴增紅藻門、定鞭藻綱的特異性與C4(F/R)雖有差異,但在其他真核藻類類群中較有優勢。

為了比較3對引物在實際樣品中對真核藻類擴增特異性的差異,對2014年5—8月采集的8、11、12號環境樣品分別進行了引物擴增,采用Illumina HiSeq2500測序平臺PE250測序,解析出在種的水平下每對引物對應的平均微型/微微型浮游植物OTUs數。結果顯示,3對引物V4(F/R)、 V9(F/R)、C4(F/R)3個站位鑒定的微型/微微型浮游植物OTUs數分別為68、73、92;37、46、44;33、59、81,平均為78、42、58。結果顯示,引物對V4(F/R)在微型/微微型浮游植物種類數鑒定方面優于其他兩對引物,故采用引物對V4(F/R)研究遼東灣海域微型/微微型浮游植物的群落多樣性。

2.2Stoeckeriaalgicida的種屬確定

高通量測序獲得Stoeckeriaalgicida部分18S rDNA序列為375bp,通過NCBI Blast比對,其在Stoeckeriaalgicida18S rDNA(AJ841809.1)基因序列中對應的位置為595—969bp,與基因庫中Stoeckeriaalgicida的18S rDNA序列相似度為100%,E值為0。采用鄰接法,選擇甲藻門中部分藻類的18S rDNA序列構建系統進化樹(圖2,節點上的數值表示鄰接法的可靠性)。建樹結果顯示,高通量測序獲得的Stoeckeriaalgicida18S V4區序列與Stoeckeriaalgicida(HG005133)聚在一個分支,其支持率為100%,確定該種為Stoeckeriaalgicida。

圖2 Stoeckeria algicida系統進化樹Fig.2 Stoeckeria algicida phylogenetic tree

2.3Stoeckeriaalgicida密度分布

遼東灣春季所有站位均未檢出Stoeckeriaalgicida,夏季密度分布在(0.023—2.753)×103個/L,平均為1.388×103個/L,最高值出現在1號站,最低值出現在14號站,高值區主要分布在遼東灣的東西兩側(1、4、7、9、10、12、13、16號站位密度均在103個/L以上),遼東灣中部海域密度相對較少;秋季密度分布在(0.011—2.488)×103個/L,平均為1.249×103個/L,最高值出現在9號站,最低值出現在12號站,高值區主要分布在遼東灣西北側的1號(1.250×103個/L)和中東側9號(2.488×103個/L)站位,其他區域密度相對較少;冬季密度分布在(0.002—0.073)×103個/L,平均為0.037×103個/L,最高值出現在3號站,最低值出現在14號站,密度量相對較少,各站位差異不大,分布較為均勻(圖3)。

2.4 優勢度

夏季Stoeckeriaalgicida優勢度在(0.03—0.41)%,平均為0.22%,優勢度最高在9號站位,最低在16號站位(6、8、9、15號站位優勢度超過0.2%);秋季優勢度在(0.03—0.54)%,平均為0.28%,優勢度最高在16號站位,最低在4號站位(6、9、11—16號站位優勢度超過0.2%);冬季優勢度在(0.02—0.34)%,平均為0.18%,優勢度最高在16號站位,最低在4號站位(7、9、11—16號站位優勢度超過0.2%)(圖4)。

圖3 不同季節Stoeckeria algicida的相對密度Fig.3 Relative Stoeckeria algicida density in different seasons

圖4 不同季節Stoeckeria algicida的優勢度Fig.4 Stoeckeria algicida dominance in different seasons

3 討論

目前有關Stoeckeriaalgicida的研究報道較少,成果主要來自韓國首爾國立大學海洋研究所赤潮研究中心[16-17],2004年首次在韓國慶南馬山海域發現胸甲球藻科一個新種S.algicida,該種曾引發兩次大規模赤潮,給漁民造成了1億多韓元的經濟損失,暴發密度可達2×107個/L,有侵噬魚類細胞殺魚的能力,可以導致魚類成群死亡,同時也會殺死其他海洋微藻。研究組以世界海洋生態學家、美國馬里蘭大學教授戴安·斯迪克(音譯)的名字結合“殺死其他赤潮生物”之意的拉丁語“algicida”將此生物的名字命名為斯迪克里亞·阿爾茲西達(音譯)。

Jeong等對異養型甲藻S.algicida的形態學特征進行了描述,并從人工培養的藻細胞中獲得核糖體小亞基rDNA序列。該藻細胞呈橢圓形,長(7.3—15.9 μm,平均11.6 μm)大于寬(2.7—12.2 μm,平均7.3 μm)。核糖體小亞基rDNA序列的GenBank登錄號為AJ841809。序列比對結果顯示,S.algicida的核糖體小亞基rDNA序列與牧羊杖地區的一種甲藻差異3%,與Cryptoperidiniopsoidsp.、brodyi、Pfiesteriasp.(有害費氏藻)差異4%。采用最大似然法構建S.algicida的核糖體小亞基rDNA序列的系統進化樹,S.algicida與有害費氏藻及近緣種、以及牧羊杖地區的一種甲藻親緣關系最為接近,卻又處在不同的分支上。基于形態學觀察和譜系分析,認為S.algicida是一個新種[15]。

為研究S.algicida對其他赤潮生物的影響,Jeong等在2004年5—6月赤潮期間監測了韓國馬上海灣赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)和S.algicida的密度變化。同時在實驗室研究S.algicida攝食赤潮異彎藻情況,檢測其生長率和捕食率。結果發現赤潮異彎藻最大密度出現在第2次赤潮期間(58400—99200 cells/mL),S.algicida為1130—17400 cells/mL,其密度的高峰期相對赤潮異彎藻要推遲1—2 d。S.algicida捕食赤潮異彎藻是先通過一個柄狀組織將其固定,然后通過細絲拖拽,在赤潮異彎藻的密度達到約3500 cells/mL飽和濃度之前,S.algicida的比生長速率隨著赤潮異彎藻密度的增加而快速升高,其最大比生長速率為1.63/d,當赤潮異彎藻的閾值濃度為1.9 ng·C/mL(19 cells/mL)時,凈生長率為0,對赤潮異彎藻的最大攝食率和清除率分別為0.75 ng C/grazer·mL(7.5 cells /grazer·mL)和3.7 μL/h。S.algicida對赤潮異彎藻的捕食系數達到0.142 cells /min(即每分鐘清除赤潮異彎藻0.13%),目前的研究結果顯示,S.algicida的攝食對赤潮異彎藻的密度影響較大[16]。

Stoeckeriaalgicida為甲藻綱胸甲球藻科,有侵噬魚類細胞殺魚的能力,可以導致魚類成群死亡,同時也會殺死其他海洋微藻,2004年首次在韓國慶南馬山海域被發現。由于該種研究較少,致災機理尚不清楚,但其與費氏藻屬(Pfiesteriasp.)同屬一科,費氏藻產生的毒素能使半咸水魚類很快死亡,表現為皮膚潰爛,失去抵抗力,有研究表明其毒素分脂溶性、水溶性兩種,脂溶性表現為皮膚傷害作用,水溶性表現為神經傷害作用,脂溶性為一種塑料增塑劑,水溶性成分是含銅和鐵元素的糖苷類物質[18]。2013—2014年在大連長興島海域曾發現大量死魚,檢測水樣中Stoeckeriaalgicida的密度在106個/L左右,接近赤潮警戒標準(107個/L)[19]。

通過對遼東灣四季Stoeckeriaalgicida的檢測,春季未檢出,冬季密度急劇下降,說明溫度是影響該藻繁殖的主要因素。夏、秋季整個海域都有檢出,雖然Stoeckeriaalgicida在整個環境樣品中優勢度不太明顯,但其密度較高,最高達2.753×103個/L,夏季主要分布在遼東灣東西兩岸,致災風險較高,應引起足夠重視。

Stoeckeriaalgicida被韓國定為外來物種,在我國海域也是首次報道,其危害后果嚴峻,必須加強監測監管。從目前遼東灣海域的Stoeckeriaalgicida密度分布來看,該種已成為歸化種,雖未發生赤潮記錄,但防患于未然,未來應從以下3方面入手：①加快研究該藻的產毒機制、生態危害、暴發風險、防御措施;②重點監測各港口海域有毒微型/微微型藻類的種群和分布,補充外來入侵微藻數據庫;③加強對養殖區產毒微藻的監測和管理,建立貝毒快速預警技術,減少對漁業生態系統的危害[20-23]。

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Distribution of the toxic dinoflagellateStoeckeriaalgicidain Liaodong Bay

SONG Lun*, LIU Weidong, WU Jing, SONG Guangjun, SONG Yonggang, SUN Ming, WANG Nianbin

KeyLaboratoryofMarineBiologicalResourcesandEcology,LiaoningOceanandFisheriesScienceResearchInstitute,LiaoningProvince,Dalian116023,China

The toxic dinoflagellate,Stoeckeriaalgicida, belongs to the family Thoracosphaeraceae. It invades fish cells, causing high fish mortality, and also kills other marine microalgae. .algicidawas first found in Masan Bay, Korea, in 2004. The morphology and ecology ofS.algicidahave been reported, and it has been identified as an invasive microalgae. Its vegetative and biflagellate cells are oval, and measure 7.3—15.9 mm (mean 11.6) and 2.7—12.2 mm (mean 7.3), respectively. Based on morphological and genealogical analyses, a previous study suggested that it could be a new species in a new genus. Grazing coefficients of up to 0.142 min-1have been reported forS.algicidaonHeterosigmaakashiwo, suggesting thatS.algicidagrazing can have a considerable impact onH.akashiwopopulations. Morphological identification ofS.algicidais difficult because of its small size, which has delayed research progress. Therefore, research onS.algicidain the China Sea has been limited. Recently, the development of high-throughput next generation sequencing (NGS) technology has increased nano- and picophytoplankton research output. To identifyS.algicidaand its distribution in Liaodong Bay, we used the 18S rDNA V4 region as the target gene to design the primer V4(F/R), and employed NGS technology to investigate nano- and picophytoplankton diversity in Liaodong Bay. The results revealed thatS.algicidawas present in Liaodong Bay in every season except spring. Temperature was a significant factor inS.algicidareproduction.S.algicidawas not dominant in the phytoplankton community, but its density was higher in summer (2.753 × 103cells/L).S.algicidadensity was high on the east and west coasts of Liaodong Bay, where the risk of disastrous ecological impacts is higher. In the study,S.algicidawas found and reported in Liaodong Bay, China,S.algicidacould be classified as a newly naturalized species based on its distribution in Liaodong Bay. Although there are no records of red tides caused byS.algicida, measures should be taken to prevent such an occurrence, rather than mitigating the effects should a red tide occur. Furthermore, monitoring and management of toxic microalgae in aquacultural areas should be increased and a red tide early warning system should be established to avoid disasters in fisheries ecosystems.

Stoeckeriaalgicida; thoracosphaeraceae; harmful microalgae; nano-phytoplankton; next generation sequencing; Liaodong Bay

中國海洋發展研究會重大項目(CAMAZDA201605);遼寧省自然科學基金資助項目(2014020182);遼寧省海洋與漁業科研項目(201611);國家自然科學基金資助項目(31400406);海洋公益性行業科研專項(201505019)

2016- 05- 24;

2016- 09- 05

10.5846/stxb201605241000

*通訊作者Corresponding author.E-mail: songlun@lnshky.com

宋倫,劉衛東,吳景,宋廣軍,宋永剛,孫明,王年斌.有害甲藻Stoeckeriaalgicida在遼東灣的時空分布.生態學報,2017,37(4):1339- 1345.

Song L, Liu W D, Wu J, Song G J, Song Y G Sun M, Wang N B.Distribution of the toxic dinoflagellateStoeckeriaalgicidain Liaodong Bay.Acta Ecologica Sinica,2017,37(4):1339- 1345.