ClC-3的表達峰度與膠質瘤細胞增殖的關系

張廣宇，賈世峰，張曉煒，曹旭華，焦保華

(1.河北醫科大學第二醫院神經外科，河北 石家莊 050000；2.華北理工大學附屬醫院腫瘤科，河北 唐山 063000)

ClC-3的表達峰度與膠質瘤細胞增殖的關系

張廣宇1，賈世峰2，張曉煒1，曹旭華1，焦保華1

(1.河北醫科大學第二醫院神經外科，河北 石家莊 050000；2.華北理工大學附屬醫院腫瘤科，河北 唐山 063000)

目的 研究氯離子通道-3(ClC-3)的表達峰度與膠質瘤細胞增殖的關系。方法選取2015年5月至2016年5月河北醫科大學第二醫院神經外科收治的20例膠質瘤患者作為觀察組，另選同期20例行顱內減壓術治療的腦創傷患者作為對照組，比較兩組患者不同ClC-3表達峰度下膠質瘤細胞增殖差異。結果觀察組患者的CIC-3mRNA、細胞周期素D1(Cyclin D1)、細胞周期素E(Cyclin E)、Ki-67、增殖細胞核抗原(PCNA)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達水平分別為(0.78±0.14)%、(81.85±21.45)%、(85.48±21.32)%、(81.25±21.34)%、(73.46±22.24)%、(0.77±0.21)%、(1.21±0.15)%，與對照組的(0.25±0.15)%、(62.31±11.55)%、(48.33± 11.10)%、(48.10±11.10)%、(23.12±11.28)%、(0.45±0.17)%、(0.77±0.18)%相比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)；觀察組內ClC-3中低表達峰度患者CIC-3 mRNA、Cyclin D1、Cyclin E、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9表達水平為(0.59±0.20)%、(64.33±1.57)%、(59.74±2.71)%、(62.33±1.25)%、(54.64±2.21)%、(0.62±0.18)%、(0.87±0.12)%，與高表達峰度患者的(0.91±0.12)%、(96.32±1.15)%、(96.48±1.20)%、(94.28±1.37)%、(85.66±2.34)%、(0.89±0.24)%、(1.33± 0.20)%相比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論ClC-3的表達峰度與膠質瘤細胞增殖關系密切，ClC-3的表達峰度越高，膠質瘤細胞增殖越顯著，可將其作為防治膠質瘤的新靶點。

氯離子通道-3；表達；峰度；膠質瘤；細胞增殖

膠質瘤為神經膠質瘤的簡稱，是指發生于神經外胚層的腫瘤，為目前臨床較為常見的顱內惡性腫瘤，不僅嚴重威脅患者生命安全，同時給臨床診療工作造成一定阻礙，已經引起了臨床的高度關注[1]。近些年來隨著醫學研究的不斷深入開展，膠質瘤細胞增殖的影響因素研究取得了階段性的成果，其中氯離子通道-3(Chloride channel-3，ClC-3)表達峰度與膠質瘤的發生與發展存在密切的關聯性，日益引起臨床的重視[2]。本研究進一步圍繞ClC-3的表達峰度與膠質瘤細胞增殖的關系展開深入研究，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年5月至2016年5月河北醫科大學第二醫院神經外科收治的20例膠質瘤患者作為觀察組，其中男性14例、女性6例；年齡25～62歲，平均(43.25±1.38)歲；病程6個月～1.5年，平均(1.00±0.15)年；Kernohan分級：Ⅱ級4例、Ⅲ級10例、Ⅳ級6例；臨床表現：頭痛5例、視力減退7例、精神癥狀8例；ClC-3表達峰度：低表達峰度9例、中表達峰度5例、高表達峰度6例。納入標準：①經臨床綜合診斷確診為膠質瘤者；②無其他全身嚴重器質性疾病者；③臨床依從性好者；④無免疫系統疾病或缺陷者。排除標準：①血液系統疾病或凝血功能障礙者；②妊娠期、哺乳期患者。另選同期20例行顱內減壓術治療的腦創傷患者作為對照組，其中男性12例，女性8例；年齡28～60歲，平均(43.18±1.45)歲；致病原因：交通事故15例、高空墜落5例；臨床表現：頭痛6例、單側或雙側瞳孔散大7例、精神癥狀7例。兩組患者的性別、年齡、臨床表現等一般資料比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 所有膠質瘤診斷符合美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)編撰的《膠質瘤臨床指引(2006)》中的以下內容：①腦脊液穿刺檢查提示腦脊液蛋白量顯著增加，白細胞計數同樣增加；②腦電圖檢查提示腫瘤部位腦電波頻率計波幅較周圍正常組織顯著改變，如：局限性δ波、棘波或尖波等；③放射性同位素掃描顯示血腦屏障通透性提高、同位素吸收率高；④頭顱平片掃描提示顱內壓增高征，腫瘤鈣化及松果體鈣化移位等[3]。

1.3 研究方法

1.3.1 膠質瘤增殖試驗方法 將入組膠質瘤患者膠質瘤細胞以2×105/mL密度接種于96孔板，按照操作說明，加入10 uL(購自于美國Santa Cruz公司) CLC-3抗體，置于5%CO2培養箱中孵育2 h，將其置入美國BioTek公司生產的ELx800酶聯免疫檢測儀中于波長450 nm處測定光密度值[4]。

1.3.2 免疫組化 將兩組患者腦組織樣本實施石蠟固定并置于烘箱之中以67℃烘片2.5 h，促使石蠟切片脫蠟至水，隨后采用pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)反復洗片3次。另取定量pH6.0檸檬酸鹽緩沖液加熱至沸騰后將切片置于其中，放入微波盒中微波處理15 min后自然冷卻[5]。利用無菌蒸餾水反復沖洗3次，每次持續時間3 min，室溫下孵育15 min，去除磷酸緩沖鹽溶液后加入聚合物增強劑，孵育25 min，磷酸緩沖鹽溶液反復沖洗3次，每次5 min，再次去除該溶液并加入酶標抗鼠/兔聚合物，孵育0.5 h，繼續經上述步驟處理，加入配置的二氨基聯苯胺溶液(diaminobenzidine，DAB)，蘇木素復染，藍化，切片經梯度酒精脫水干燥后于顯微鏡下觀察[6]。

1.3.3 ClC-3表達峰度結果判定 將間質瘤細胞胞膜或者是胞漿內出現棕黃色染色定義為陽性細胞，連續取20個視野計算平均值，并以陽性細胞數＜10%作為低表達、陽性細胞數10%～30%為中表達、陽性細胞數＞30%為高表達[7]。

1.4 觀察指標 觀察不同組別CIC-3mRNA、細胞周期素D1(Cyclin D1)、細胞周期素E(Cyclin E)、Ki-67、增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)表達水平。

2 結果

2.1 兩組患者的膠質瘤細胞增殖指標比較 對照組CIC-3蛋白陰性表達及觀察組的陽性表達見圖1、圖2；觀察組患者的CIC-3mRNA、Cyclin D1、Cyclin E、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9表達水平與對照組相比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

圖1 CIC-3蛋白在對照組的陰性表達(×400)

圖2 CIC-3蛋白在觀察組的陽性表達(×400)

表1 兩組患者的膠質瘤細胞增殖指標比較(±s，%)

表1 兩組患者的膠質瘤細胞增殖指標比較(±s，%)

組別對照組觀察組t值P值例數20 20 CIC-3mRNA 0.25±0.15 0.78±0.14 11.552＜0.05 Cyclin D1 62.31±11.55 81.85±21.45 6.764＜0.05 Cyclin E 48.33±11.10 85.48±21.32 8.298＜0.05 Ki-67 48.10±11.10 81.25±21.34 7.986＜0.05 PCNA 23.12±11.28 73.46±22.24 9.029＜0.05 MMP-2 0.45±0.17 0.77±0.21 4.892＜0.05 MMP-9 0.77±0.18 1.21±0.15 7.637＜0.05

2.2 觀察組內不同ClC-3表達峰度患者膠質瘤細胞增殖指標比較 觀察組內中低表達峰度患者與高表達峰度患者膠質瘤細胞增殖指標表達水平相比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 觀察組內膠質瘤細胞增殖指標比較(±s，%)

表2 觀察組內膠質瘤細胞增殖指標比較(±s，%)

組別中低峰度高峰度t值P值例數14 6 CIC-3mRNA 0.59±0.20 0.91±0.12 3.616＜0.05 Cyclin D1 64.33±11.57 96.32±21.15 4.411＜0.05 Cyclin E 59.74±12.71 96.48±21.20 5.732＜0.05 Ki-67 62.33±11.25 94.28±21.37 5.343＜0.05 PCNA 54.64±12.21 85.66±22.34 5.449＜0.05 MMP-2 0.62±0.18 0.89±0.24 2.788＜0.05 MMP-9 0.87±0.12 1.33±0.20 6.428＜0.05

3 討論

近年來，大量臨床研究證實膠質瘤具有較高的特異性，侵襲能力顯著，并且對于放化療的抵抗能力較強，所以該腫瘤已經成為了中樞神經系統致死率最高的惡性腫瘤之一[8]。目前該病治療的難點集中于膠質瘤細胞增殖以及組織浸潤廣泛，所以尋求能夠阻斷膠質瘤細胞惡性增殖與浸潤的分子靶點成為醫學界研究的熱門議題。

隨著臨床研究的不斷深入開展，細胞內離子通道在調控腫瘤細胞生長周期方面發揮了重要的作用，尤其是腫瘤細胞在攝取到充足的營養物質后內部滲透壓隨之升高，促使細胞外的水分子進入到細胞內，使得細胞容積大幅增加，激活氯離子(Cl-)通道，導致自身的氯離子外流[9]。容積調節性氯通道(volume regulated chloride channel，VRCC)全程參與到了腫瘤細胞的增殖過程，對其展開研究將有助于探尋更加有效的診療方案[10]。本次研究證實，觀察組CIC-3mRNA、Cyclin D1、Cyclin E、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9表達水平均顯著高于正常對照組，而觀察組內中低表達峰度的膠質瘤患者CIC-3mRNA、Cyclin D1、Cyclin E、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9表達水平低于高表達峰度患者。由此結果可知，ClC-3的表達峰度與膠質瘤細胞增殖呈現出密切相關，而此種關聯性對于阻斷膠質瘤細胞的增殖具有重要意義。

綜上所述，ClC-3的表達峰度與膠質瘤細胞增殖密切相關，ClC-3的表達峰度越高，膠質瘤細胞增殖越顯著，可將其作為防治膠質瘤的新靶點。

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Relationship between ClC-3 expression kurtosis and glioma cell proliferation.

ZHANG Guang-yu1,JIA Shi-feng2, ZHANG Xiao-wei1,CAO Xu-hua1,JIAO Bao-hua1.1.Department of Neurosurgery,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,Hebei,CHINA;2.Department of Oncology,the Affiliated Hospital of North China University of Science&technology,Tangshan 063000,Hebei,CHINA

ObjectiveTo study the relationship of chloride channel-3(ClC-3)expression with glioma cell proliferation.MethodsFrom May 2015 to May 2016,20 patients with glioma in the Second Hospital of Hebei Medical University were enrolled as the observation group,and 20 patients with traumatic brain injury undergoing intracranial decompression were selected as the control group.Glioma cell proliferation under different ClC-3 expression kurtosis was compared between the two groups.ResultsCIC-3 mRNA,Cyclin D1,Cyclin E,Ki-67,proliferating cell nuclear antigen(PCNA),MMP-2 and MMP-9 expression levels in the observation group were(0.78±0.14)%,(81.85±21.45)%, (85.48±21.32)%,(81.25±21.34)%,(73.46±22.24)%,(0.77±0.21)%,(1.21±0.15)%,as compared with(0.25±0.15)%, (62.31±11.55)%,(48.33±11.10)%,(48.10±11.10)%,(23.12±11.28)%,(0.45±0.17)%,(0.77±0.18)%in the control group (P＜0.05).In the observation group,CIC-3 mRNA,Cyclin D1,Cyclin E,Ki-67,PCNA,MMP-2,MMP-9 in patients with low expression kurtosis were(0.59±0.20)%,(64.33±11.57)%,(59.74±12.71)%,(62.33±11.25)%,(54.64±12.21)%, (0.62±0.18)%,(0.87±0.12)%,as compared with(0.91±0.12)%,(96.32±21.15)%,(96.48±21.20)%,(94.28±21.37)%, (85.66±22.34)%,(0.89±0.24)%,(1.33±0.20)%in patients with high expression kurtosis,(P＜0.05).ConclusionClC-3 expression kurtosis is positively correlated with glioma cell proliferation,which may be used as a new target for the prevention and treatment of glioma.

Chloride channel-3(ClC-3);Expression;Kurtosis;Glioma;Cell proliferation

R730.264

A

1003—6350（2017）06—0877—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.005

2016-09-30)

焦保華。E-mail：13932193056@163.com