草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白提取及活性肽制備研究

賀江，趙自龍，彭磊，楊浩，黃冰

（湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖與加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德415000）

草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白提取及活性肽制備研究

賀江，趙自龍，彭磊，楊浩，黃冰

（湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖與加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德415000）

以草魚(yú)魚(yú)鱗為原材料，探討其膠原蛋白酸-酶組合提取工藝，并進(jìn)一步研究相應(yīng)抗氧化活性肽和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制（ACEI）活性肽的制備方法。結(jié)果表明，草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白提取的最優(yōu)工藝為：乙酸濃度0.3mol/L、乙酸提取固液比1∶15（g/mL）條件下低溫下提取24 h；離心后剩余殘?jiān)侔?∶10（g/mL）的比例浸入濃度為2%的胃蛋白酶溶液中低溫下提取48h；在該條件下魚(yú)鱗膠原蛋白提取得率可達(dá)49.58%。以草魚(yú)膠原蛋白粗提液為原料，制備抗氧化活性肽的最優(yōu)工藝為：控制膠原蛋白濃度12.5mg/mL，按10∶1（體積比）的比例加入濃度為4%的木瓜蛋白酶，60℃下酶解75min，所得酶解液對(duì)ABTS+自由基的抑制率可達(dá)45.7%；制備ACEI活性肽的最優(yōu)工藝為：控制膠原蛋白濃度20mg/mL，pH值調(diào)節(jié)為4.0，每10mL加入6000U的酸性蛋白酶，37℃酶解3 h，所得酶解液對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的抑制活性可達(dá)98.8%。本研究結(jié)果，有望為水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的資源化利用提供參考。

魚(yú)鱗；膠原蛋白；抗氧化肽；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽

我國(guó)水養(yǎng)殖業(yè)近年來(lái)發(fā)展迅速，產(chǎn)量已位居世界首位；水產(chǎn)品加工業(yè)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的延伸，也是進(jìn)一步推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵所在。對(duì)于草魚(yú)、鳙魚(yú)等主養(yǎng)淡水魚(yú)的加工，目前已經(jīng)取得了較大的發(fā)展，冷鮮魚(yú)、速凍魚(yú)片、魚(yú)糜系列產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)已呈現(xiàn)規(guī)模；但在這些淡水魚(yú)類(lèi)的加工過(guò)程中，往往會(huì)產(chǎn)生出占魚(yú)體總重約40%～55%的下腳料（包括魚(yú)頭、魚(yú)皮、魚(yú)鰭、魚(yú)尾、魚(yú)骨及其殘留魚(yú)肉等）。目前，這些加工副產(chǎn)物主要被用來(lái)生產(chǎn)飼料魚(yú)粉，但實(shí)際上其中還含有一系列較有價(jià)值的成分可以挖掘。

膠原蛋白提取以及各類(lèi)生物活性肽的開(kāi)發(fā)，是當(dāng)前水產(chǎn)加工副產(chǎn)物綜合開(kāi)發(fā)利用研究的熱點(diǎn)之一[1-3]。但現(xiàn)有研究主要集中于海洋魚(yú)類(lèi)或近海魚(yú)類(lèi)，針對(duì)主養(yǎng)淡水魚(yú)及其加工廢棄物中的膠原蛋白提取工藝及生物活性肽制備相關(guān)研究較少。就膠原蛋白的提取而言，其工藝方法包括酸法[4-5]、堿法[6]、酶法[7-8]和熱水抽提法[9-10]等多種，但每種方法均有其優(yōu)勢(shì)和不足，所以目前的趨勢(shì)將兩種甚至多種提取方法進(jìn)行組合，以提高提取得率。在生物活性肽的制備方面，雖然在抗氧化和降血壓活性肽的制備、純化，以及結(jié)構(gòu)分析等方面已經(jīng)開(kāi)展了一系列工作，但針對(duì)生物活性肽的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，進(jìn)而提高制備效率，仍然是一項(xiàng)有價(jià)值的工作。

基于上述背景，本研究以草魚(yú)魚(yú)鱗為原料，采用酸-酶組合提取工藝進(jìn)行膠原蛋白提取，并進(jìn)一步進(jìn)行抗氧化活性肽和降血壓活性肽的制備，通過(guò)對(duì)相關(guān)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期為生產(chǎn)實(shí)際提供一定的參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮草魚(yú)魚(yú)鱗（取自常德當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)）：將魚(yú)鱗清洗干凈，放入0.5mol/L稀鹽酸溶液中浸泡，去除魚(yú)鱗中的金屬離子，處理完成后用水沖洗，撈出后用清水洗滌至中性，最后烘干、剪碎備用。胃蛋白酶（3.0× 103U/mg）：上?；瘜W(xué)試劑公司；中性蛋白酶（6.0×104U/ g）：無(wú)錫杰能科酶制劑公司；堿性蛋白酶（2.0×105U/ g）：丹麥諾維信公司；酸性蛋白酶（5.0×104U/g）：上海生物試劑公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（1.4×103U/g）、木瓜蛋白酶（≥10U/mg）、2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）（G.R）、Hip-His-Leu（分析純）、卡托普利（分析純）：美國(guó)sigma公司；考馬斯亮蘭蛋白含量測(cè)定試劑盒：上海荔達(dá)生物科技有限公司；馬尿酸（分析純）：上海展云化工有限公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津；PL303型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-16G型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；P680型高效液相色譜儀：美國(guó)戴安公司；其他常規(guī)儀器和玻璃器皿。

1.3方法與步驟

1.3.1魚(yú)鱗膠原蛋白的酸-酶組合提取工藝

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g預(yù)處理過(guò)的魚(yú)鱗樣品，加入一定濃度的適量乙酸溶液，然后在低溫下提取24 h；將酸提液于8 000 r/min條件下離心20min，收集上清液；剩余殘?jiān)?∶10（g/mL）的比例浸入一定濃度的適量胃蛋白酶溶液中，低溫下提取48h；酶提液在相同條件下離心后，合并上清液，即得到膠原蛋白粗制液。本試驗(yàn)旨在提取非變性膠原蛋白，因此提取溫度控制在15℃左右。

采用考馬斯亮蘭蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定膠原蛋白粗制液的蛋白濃度，按如下公式計(jì)算膠原蛋白提取得率，并以提取得率為觀(guān)測(cè)指標(biāo)進(jìn)行提取工藝參數(shù)的優(yōu)化。

式中：W為膠原蛋白提取得率，%；C為膠原蛋白濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；M為魚(yú)鱗樣品重量，g。

1.3.2抗氧化活性膠原蛋白肽的制備工藝

以1.3.1所獲得的魚(yú)鱗膠原蛋白粗制液為原料，將其調(diào)節(jié)至一定濃度后調(diào)節(jié)pH值至6.0；然后取10mL該膠原蛋白溶液加入1mL一定濃度的木瓜蛋白酶；在60℃下酶解一定時(shí)間后，將其置于100℃的沸水中處理10min滅酶；最后，將酶解液于4 000 r/min條件下離心20min，并收集上清進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。

參照文獻(xiàn)[11]，采用ABTS法測(cè)定膠原蛋白酶解液的體外抗氧化活性（自由基清除率），并以此為指標(biāo)進(jìn)行酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化。

1.3.3降血壓活性膠原蛋白肽的制備工藝

以1.3.1所獲得的魚(yú)鱗膠原蛋白粗制液為原料，調(diào)整濃度為20mg/L，再取3份分別將其pH值調(diào)節(jié)至4.0、7.0、9.0；然后各取10mL分別加入相同酶活單位（6 000 U）的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶并混合；將混合液置于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)保溫酶解3 h后，取出反應(yīng)液并置于100℃的沸水中處理10min滅酶；最后，將酶解液于4 000 r/min條件下離心20min，并收集上清進(jìn)行降血壓活性測(cè)定。

參照文獻(xiàn)[12]，采用HPLC法測(cè)定膠原蛋白酶解液的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性（ACEI活性），并以此為指標(biāo)進(jìn)行最佳酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

2.1草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白提取工藝

本研究采用酸-酶組合提取工藝對(duì)草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究選定乙酸濃度、乙酸提取固液比、胃蛋白酶濃度作為主要影響因素，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)魚(yú)鱗膠原蛋白酸-酶組合提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 膠原蛋白提取工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table1 Optim ization resultsoforthogonal test for the collagen extraction process

由表1可知，在所考查的3個(gè)因素中，對(duì)草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白提取得率的影響大小順序?yàn)槊笣舛龋疽宜釢舛龋疽宜崽崛」桃罕?；而所考察?個(gè)因素的最優(yōu)參數(shù)組合為乙酸濃度0.3mol/L、乙酸提取固液比1∶15（g/mL）、酶濃度2%，在該條件下魚(yú)鱗膠原蛋白提取得率為49.58%。

2.2抗氧化活性膠原蛋白肽制備工藝

本研究以魚(yú)鱗膠原蛋白粗提液為原料，利用木瓜蛋白酶對(duì)其進(jìn)一步酶解以制備高抗氧化活性和降血壓活性的膠原蛋白肽。試驗(yàn)選擇魚(yú)鱗膠原蛋白的底物濃度、酶濃度、以及木瓜蛋白酶的酶解時(shí)間3個(gè)關(guān)鍵因素，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 抗氧化活性膠原蛋白肽制備工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table2 Optim ization resultsof orthogonal test for theprocessof antioxidativepeptide preparation

續(xù)表2抗氧化活性膠原蛋白肽制備工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Continue table2 Optim ization resultsof orthogonal test for the processof antioxidative peptidepreparation

由表2可知，所考察的各因素對(duì)ABTS+自由基清除率的影響次序?yàn)椋旱孜餄舛龋久附鈺r(shí)間＞酶濃度；經(jīng)方差分析可知，底物濃度對(duì)ABTS+自由基清除率的影響達(dá)到顯著水平。對(duì)上表進(jìn)行直觀(guān)分析可知，抗氧化活性膠原蛋白肽的最佳制備工藝參數(shù)為，底物濃度12.5mg/mL、木瓜蛋白酶濃度4%、反應(yīng)時(shí)間75min；經(jīng)進(jìn)一步驗(yàn)證，在該工藝參數(shù)組合下，膠原蛋白酶解液的ABTS+自由基抑制率可達(dá)45.7%，與未經(jīng)處理的膠原蛋白粗提液（ABTS+自由基抑制率為7.9%）相比，有顯著提高。

2.3降血壓活性膠原蛋白肽制備工藝

本研究利用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶分別處理魚(yú)鱗膠原蛋白粗提液樣品，得到3種酶解產(chǎn)物，酶解后將各酶解液的pH值調(diào)至中性；以0.1mol/L硼酸緩沖液為空白對(duì)照，未經(jīng)酶解處理的樣品為陰性對(duì)照，參照文獻(xiàn)[12]所述方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，利用HPLC法測(cè)定各樣品中馬尿酸的含量后計(jì)算出各樣品的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性（ACEI），結(jié)果如表3所示。

表3 草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白經(jīng)不同蛋白酶酶解后ACEI活性比較Table3 The ACEIactivity of grass carp fish scale collagen enzym olysised by different protease

由表3可知，未經(jīng)酶解處理的膠原蛋白粗提液對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制活性為44.46%，這是由于在酸-酶提取過(guò)程中，膠原蛋白發(fā)生了部分水解，生產(chǎn)的小分子多肽表現(xiàn)出一定的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性。經(jīng)不同蛋白酶酶解處理后，酶解液的ACEI活性均明顯提高，其中酸性蛋白酶酶解液的ACEI活性最高，達(dá)98.78%。因此，酸性蛋白酶是利用草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白制備降血壓活性肽的最佳酶制劑。

3討論與結(jié)論

食物源生物活性肽的制備是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，以水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物為原料進(jìn)行生物活性肽的制備則具有顯著的實(shí)際意義。本研究以草魚(yú)魚(yú)鱗為原料，采用酸-酶組合提取工藝對(duì)其膠原蛋白進(jìn)行提取，并在此基礎(chǔ)上探討了抗氧化活性肽和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽的制備，所獲研究結(jié)果，可為水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的資源化利用提供一定參考。進(jìn)一步的研究可從活性肽的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、活性機(jī)理等方面著手。

本研究結(jié)果表明，草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白酸-酶組合提取的最優(yōu)工藝為：乙酸濃度0.3mol/L、乙酸提取固液比1∶15（g/mL）條件下低溫下提取24 h；離心后剩余殘?jiān)侔?∶10（g/mL）的比例浸入濃度為2%的胃蛋白酶溶液中低溫下提取48 h；在該條件下魚(yú)鱗膠原蛋白提取得率可達(dá)49.58%。以草魚(yú)膠原蛋白粗提液為原料，制備抗氧化活性肽的最優(yōu)工藝為：控制膠原蛋白濃度12.5mg/mL，按10∶1（體積比）的比例加入濃度為4%的木瓜蛋白酶，60℃下酶解75min，所得酶解液對(duì)ABTS+自由基的抑制率可達(dá)45.7%；制備ACEI活性肽的最優(yōu)工藝為：控制膠原蛋白濃度20mg/mL，pH值調(diào)節(jié)為4.0，每10mL加入6 000U的酸性蛋白酶，37℃酶解3 h，所得酶解液對(duì)ACE的抑制活性可達(dá)98.78%。

[1]陳麗麗,趙利,劉華,等.水產(chǎn)品膠原蛋白的研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2012,33(1):205-208

[2]郭玉華,劉揚(yáng)瑞,李鈺金.魚(yú)類(lèi)膠原蛋白及膠原活性多肽的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品添加劑,2010(3):175-179

[3]張俊杰,段蕊,杜修橋.魚(yú)鱗膠原蛋白的提取及其性質(zhì)研究[J].中國(guó)水產(chǎn),2015(10):68-69

[4]戶(hù)業(yè)麗,吳潔,張瑞,等.酸法提取人工養(yǎng)殖鱘魚(yú)皮中膠原蛋白工藝的研究[J].食品科技,2008,33(2):209-212

[5]胡建平.魚(yú)鱗膠原蛋白的酸法提取及性質(zhì)研究[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì),2012(3):141-148

[6]溫慧芳,趙利,陳麗麗,等.堿法提取鮰魚(yú)皮膠原蛋白工藝優(yōu)化的研究[J].食品工業(yè)科技,2015,36(19):233-236

[7]程波,吳潔,張玉蓉,等.酶法提取人工養(yǎng)殖鱘魚(yú)皮中膠原蛋白的工藝研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2009,30(3):1-4

[8]韓鳳杰,趙征.酶法制取比目魚(yú)皮膠原蛋白寡肽[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2006,27(8):104-107

[9]劉石生,易美華,黃文艷.熱水提取羅非魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2006,22(4):139-141

[10]趙睿,王曉丹,祖國(guó)仁,等.熱水法抽提鱈魚(yú)皮膠原蛋白條件的響應(yīng)面分析[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,30(2):98-100

[11]賀江,向球,蔡翠玲,等.真姬菇多糖超聲波輔助提取工藝及抗氧化活性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(4):232-234

[12]吳瓊英,馬海樂(lè),駱琳,等.高效液相色譜法測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的活性[J].色譜,2005,23(1):79-81

Extraction of Collagen from Fish Scale of Grass Carp and Preparation of Bioactive Peptide

HE Jiang，ZHAOZi-long，PENGLei，YANGHao，HUANGBing
（Collegeof Life Science，Hunan University ofArtand Science/Hunan Provincial Key LaboratoryofAquatic Healthy Farmingand Processing in Dongting Lake/Collaborative Innovation Center forEfficientand Healthy Production of Fisheries in Hunan Province，Changde415000，Hunan，China）

Fish scale ofgrass carp was used as row material for collagen extraction，and then the extractswere used for antioxidative peptide and angiotensin converting enzyme inhibitory peptide preparation.The optimal processofcollagen extractionwasas follow：acetic acid（0.3mol/L）wasaddedwith the ratioof1∶15（g/mL）and extracted for 24 h under low temperature，then centrifugated and the residueswere further extracted for 48 hoursby2%proteasewith the ratioof1∶10（g/mL）.By thisprocess，theextraction rateofcollagenwas49.58%. The optimal process ofantioxidative peptide preparation was as follow：collagen concentration was adjusted to 12.5mg/mL，4%papain solution wasadded with the volume ratio of10∶1，and then enzymatic hydrolysis for 75minutesunder 60℃.The inhibition ratio of the end product to ATBS+free radicalwas45.7%.The optimal process of angiotensin converting enzyme inhibitory peptide preparation was as follow：collagen concentration was adjusted to 20mg/mL and pH to 4.0，6 000 U acid proteinasewas added to 10mL collagen solution，and then enzymatic hydrolysis for3 hoursunder37℃.The inhibition ratio of the end product to angiotensin converting enzymewasup to 98.8%.These results can provide some reference for resource utilization of the byproducts ofaquatic productprocessing.

fish scale；collagen；antioxidativepeptide；angiotensin convertingenzyme inhibitorypeptide

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.012

2016-06-15

湖南省常德市聯(lián)合基金項(xiàng)目（2015JJ5008）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401583）

賀江（1983—），男（漢），副教授，博士，主要從事食品安全與食品生物技術(shù)方面的研究。