濃香型白酒酒糟中淀粉的提取

刁沖，李麗，王祥余，郭玉柳，游齊，宗緒巖，*

（1.四川理工學院，四川自貢643000；2.諾維信（中國）投資有限公司，北京100085；3.黑龍江大學，黑龍江哈爾濱150080；4.四川郎酒集團有限責任公司，四川瀘州646523）

濃香型白酒酒糟中淀粉的提取

刁沖1，李麗1，王祥余2，郭玉柳3，游齊4，宗緒巖1，*

（1.四川理工學院，四川自貢643000；2.諾維信（中國）投資有限公司，北京100085；3.黑龍江大學，黑龍江哈爾濱150080；4.四川郎酒集團有限責任公司，四川瀘州646523）

以濃香型白酒酒糟為原料，研究了酶法、堿法、SDS法對淀粉純度的影響。研究表明：酶法提取的酒糟淀粉純度最高；同時在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用三因素三水平響應面分析法對酒糟淀粉提取工藝進行優化研究，確定酶法提取酒糟淀粉的最佳工藝參數：酶添加量為2%，pH3.5，酶解溫度40℃。該條件下得到酒糟淀粉純度為70.23%。酶法制得的酒糟淀粉理化特性為：掃描電鏡圖片顯示該提取方法未對淀粉顆粒造成損傷；與原淀粉相比，晶體類型從A型變為A+V型，這可能與釀酒工藝有關，而與提取方法無關。

濃香型白酒酒糟；淀粉；提取；響應面法；理化性質

酒糟是酒醅在窖內發酵完后再經蒸餾出酒后殘留的混合固形物，結合濃香型白酒的釀造特點來看，濃香型白酒酒糟中含有很多未利用完的淀粉、蛋白質、脂肪和多種酸性物質，這些成分主要來自于釀造原料中。酒糟中主要成分含量為粗淀粉的含量在5.71%～11.34%，粗蛋白的含量5.0%～13.84%，以及粗脂肪1.31%～3.24%[1]。現在對白酒酒糟的研究主要集中在對酒糟的利用問題上。比如：生產飼料、培養食用菌、提取化學物質、作為發酵原料[2-5]。這些酒糟主要針對的是發酵完成之后丟棄的酒糟。由于濃香型白酒釀造工藝的特點之一是續糟發酵，因此一部分酒糟會循環利用，而當今對釀造過程中酒糟成分的研究較少。尤其是酒糟中的淀粉類物質，因為這部分淀粉對后續的生產以及丟糟的再利用有顯著的影響。要對酒糟中的淀粉進行研究，首先需要提取出一定純度的淀粉。

淀粉的提取方法主要有稀堿液提取法、表明活性劑法、酶法。3種方法主要將蛋白質視為主要雜質，這適用于酒糟中淀粉的提取。堿法提取依據為堿液能使包裹在淀粉顆粒外的蛋白質體結構變疏松，同時對蛋白質分子間的次級鍵特別是氫鍵有破壞作用，可使某些極性基團發生解離，從而對蛋白質分子有增溶作用，促進淀粉和蛋白質的分離[6]。表面活性劑法是利用烷基苯磺酸鈉等表面活性劑與蛋白質結合，使蛋白質形成絡合物變性，從而有利于打斷蛋白分子間的氫鍵，使蛋白展開，暴露極性基團，SDS和蛋白形成類似項鏈結構的SDS-蛋白復合物，展開的蛋白被SDS膠素團包圍，陰離子表面活性劑中的離子基團可以形成更多的靜電引力而有利于蛋白和淀粉的分離[7]。酶法的原理是利用蛋白酶將包裹在大米淀粉外層的蛋白質水解，使淀粉與蛋白質體的結合變疏松，從而在水解過程中逐步釋放蛋白質，實現大米淀粉與蛋白的分離[6]。而酒糟中淀粉的提取，還鮮見有報道，因此本試驗先在3種方法中選擇一種，選擇依據是提取淀粉的純度，然后在對其進行優化，從而得到適合酒糟中淀粉提取的方法。

鑒于此，本文將響應面分析法應用于發酵過程酒糟中淀粉提取條件的優化，以提高淀粉的純度，確立酒糟中淀粉的最佳提取條件。并對提取的淀粉進行相關的性質研究。以期為后續酒糟淀粉的研究提供一定的參考，以及為酒糟后續的再利用提供一定的基礎理論。

1材料與方法

1.1材料與試劑

出窖酒糟：四川綿陽豐谷酒廠提供；酸性蛋白酶：北京奧博星生物技術有限責任公司；乙醇、苯酚、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、葡萄糖，均為分析純：購于成都市科龍化工試劑廠。

1.2儀器與設備

Lynx6000高效落地高速離心機：美國Thermo公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；UV2400紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SHD-Ⅲ型循環水式多用真空泵：常州普天儀器制造有限公司；S4EXPLORER X射線熒光分析儀、Bruker/D2PHASER X射線衍射儀：德國Bruker AXS公司；VEGA 3SBU掃描電子顯微鏡：捷克TESCAN公司；Alpha1-2LDplus冷凍干燥機：德國Marin Christ；攪拌機：廣東美的精品電器制造有限公司。

1.3酒糟淀粉提取方法

1.3.1堿法

參照蘆鑫[8]的方法并做一定的變化。先將酒糟與蒸餾水按質量比為1∶6的料液比混合磨碎過40目篩，除去糠殼、高粱皮等雜質；水洗離心多次，將過篩液調成中性，然后制備0.2%的NaOH溶液浸泡酒糟，料液比按質量比為1∶6，每小時攪拌一次，處理10 h，排除混濁的上清液，反復更換浸泡溶液。浸泡處理結束之后，過80目篩；得到初步的淀粉溶液，多次離心（3 000 r/min×20min）洗滌淀粉，直至用酚酞檢查上清液不再顯示粉紅色，將調節pH為中性，最后收集淀粉冷凍干燥，研磨并過100目篩。裝袋并在4℃的條件下保存備用。

1.3.2 SDS法

參照郭曉冬[9]的方法并做一定的修改。先將酒糟與蒸餾水按質量比1∶6的料液比混合磨碎過40目篩，除去糠殼、高粱皮等雜質，水洗離心多次，將過篩液調成中性，然后制備1%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，使用前加0.1%亞硫酸鈉（Na2SO3）浸泡酒糟，按質量比為1：4的料液比浸泡；每小時攪拌一次，處理12 h，排除混濁的上清液，反復更換浸泡溶液。浸泡處理結束之后，過80目篩；得到初步的溶液，3 000 r/min離心20min，收集沉淀得到酒糟淀粉，然后通過離心的方法用蒸餾水水洗酒糟淀粉洗去SDS溶液；最后收集淀粉冷凍干燥，研磨并過100目篩。裝袋并在4℃的條件下保存備用。

1.3.3酶法

參照郭曉冬[9]的方法并做一定的修改。將酒糟與蒸餾水按質量比1∶6的料液比混合磨碎過40目篩，去除糠殼等雜質；水洗離心多次，將過篩液調成中性；配制pH為4的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液浸泡過篩液；加入一定量的酸性蛋白酶，在40℃的條件下酶處理10 h，酶解時間結束之后，過80目篩；得到初步的溶液，3 000 r/min離心20min，收集沉淀得到酒糟淀粉，然后通過多次離心的方法用蒸餾水水洗酒糟淀粉為中性；最后收集淀粉冷凍干燥，研磨并過100目篩。裝袋并在4℃的條件下保存備用。

1.4酶法提取酒糟淀粉工藝參數的優化試驗

通過對3種方法的對比試驗，以淀粉純度為參考指標可以知道酶法的提取效果較好，因此，選擇酶法來進行單因素響應面優化試驗；3種方法對比試驗結果在結果與分析中體現。同時為了更好的提高淀粉純度，重新對酶法的提取工藝做一定的改進。

將酒糟與蒸餾水按質量比為1∶6的料液比混合，攪拌0.5 h，用攪拌機磨5min；接著過40目篩，去除糠殼等雜質；過篩液體3 000 r/min離心15min，棄上清液，離心3次；沉淀物用70%酒精溶液浸泡處理3 h，浸泡液3 000 r/min離心15min，棄上清液，離心5次；最后淀粉沉淀物用酸性蛋白酶處理10 h（用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制成不同pH值的浸泡液）；過80目篩然后用蒸餾水洗滌沉淀物4次～6次，直到中性，冷凍干燥粉碎、過100目篩，裝袋并在4℃的條件下保存備用。

以提取淀粉的純度為參考指標，優化酶法提取酒糟淀粉工藝參數和試驗參數如表1所示。固定料液比為質量比1∶6，酶解時間為10 h。

表1 響應面試驗因素與水平Table1 Variablesand levels in Box-Benhnken experimental design

1.5淀粉理化性質測定方法

1.5.1淀粉含量的測定

參照翁忠嵐[10]的方法并稍作改變。稱取5 g提取得到的淀粉到燒瓶中，然后加入100mL濃度為體積比為4∶1的鹽酸溶液（蒸餾水：濃鹽酸）和沸石。安裝好回流裝置，加熱至沸騰，沸騰之后計時1 h。加入碘液檢測是否水解完全。水解完畢之后，冷卻水解液至室溫。過濾、洗滌水解液定容到500mL容量瓶中；取50mL定容之后的水解液調節pH到6～7；接著定容到100mL容量瓶中。取一定量的水解液用DNS試劑檢測，對比標準曲線得到還原糖的含量，試驗結果乘以0.9得到淀粉含量。

1.5.2微觀形態的觀察

參照高群玉[11]等的方法。將適量待測樣品用導電雙面膠固定于載物臺上，在真空條件下進行鍍金處理，然后將樣品臺放入掃描電子顯微鏡中觀察，并拍攝具有代表性的樣品顆粒形貌照片。

1.5.3晶體結構分析

在高群玉[11]等的方法基礎下做一定的改進，將淀粉樣品在相對濕度為100%的條件下平衡水分24 h，然后進行X-射線衍射分析。測定條件：靶型：Cu；掃描范圍為4°～70°；掃描速度為10°/min；管壓為40 kV，管流為40mA；掃描步長為0.02°。相對結晶度的計算參照陳翠蘭[12]等的方法。

1.6數據分析處理

各組數據均為3次重復測定求平均值，結果表示為平均值±標準差。并采用Excel和origin 8.5作圖，圖表中字母或者數字的不同代表差異顯著（P＜0.05）。采用Excel對數據進行統計分析，并用SPSSStatstics Version 20進行顯著性分析（P＜0.05）和多重比較。X射線衍射數據采用MDIJade5.0進行分析。

2結果與分析

2.1提取方法的選擇

采用不同方法對濃香型白酒酒糟中淀粉進行提取，其提取結果見表2。

表2 不同提取方法試驗結果Table2 Experimental resultby differentm ethods %

從提取的試驗的淀粉純度來看，酶法的提取效果最佳。通常淀粉的提取方法都是堿法或者SDS法，比如何義萍[13]等利用堿法提取燕麥淀粉，提取率能夠達到85.62%；張兆麗[14]等利用堿法提取花生淀粉，其純度能夠達到95.72%；Beta[15]等利用超聲波處理并結合0.5%的SDS和0.5%的NaOH溶液浸泡高粱籽粒再經離心洗滌后可萃取出蛋白質質量分數僅為0.06%的高粱淀粉。

而堿法和SDS法提取酒糟中的淀粉卻沒有得到較為滿意的效果，這可能與酒糟成分的復雜有關；酒糟中含有蛋白質、脂肪、纖維素、礦物元素及少量的淀粉等營養物質[16]；另外由于整個發酵釀酒過程中產生了各種各樣復雜的生物化學變化，所以其中也產生了相當多的新成分，如核糖核酸、嘌呤、嘧啶和其他一些次級代謝產物[17]；同時，濃香型白酒酒糟在生產過程中反復蒸煮、發酵，原料糧食和輔料稻殼中的纖維、半纖維結構破壞，性質與淀粉相似，提取時混入難于分離。

堿法和SDS法對蛋白質的分解作用極有可能受到各種物質的影響，從而使得提取的效果不理想。淀粉純度也無法達到一個較高的程度。而酶法卻具有單一性的作用機制，因此其他物質對其影響較小。酶法能夠使蛋白質網狀結構逐漸被破壞，使其對淀粉的束縛力變小[18]，從而使得蛋白質能夠被分解成小分子的多肽和氨基酸。這也是酶能夠高效的與底物接觸，促進了酒糟中淀粉和蛋白質的分離以及蛋白質的分解，因而使得淀粉純度逐漸增加。這也是酶法能夠較高純度酒糟淀粉的原因。

2.2響應面試驗設計與結果分析

2.2.1 Box-Behnken試驗回歸模型的建立及顯著性檢驗

以淀粉純度為響應值，利用Design-Expert軟件優化酒糟淀粉提取工藝參數。通過17次試驗得到酒糟淀粉提取的最佳工藝條件，響應面試驗設計及結果見表3。固定料液比為1∶6（質量比）、酶解時間10 h。

表3 響應面試驗設計與結果Table3 Box-Benhnken responsesurface design and resu lts

2.2.2回歸模型的有效性及顯著性分析

利用Design-Expert8.0軟件對表3數據進行多元回歸擬合，獲得酶添加量、pH、酶解溫度與酒糟淀粉純度之間的二次多項回歸方程：

該模型的方差分析結果見表4。

由表4可知，回歸模型的P值小于0.01即模型高度顯著，失擬檢驗大于0.05即失擬檢驗不顯著。這兩點可以看出回歸模型與實際情況擬合很好，實驗誤差小。模型中一次項A、B、C均高度顯著，證明酶添加量、pH、酶解溫度對淀粉純度都有顯著的影響；交互項AB顯著，說明酶添加量和pH交互作用對淀粉純度有顯著影響；二次項A2、B2、C2均極其顯著。

表4 回歸方程的方差分析Table4 Analysisofvarianceof regression equation

根據方差分析可以知道交互項AC、BC項的P值都大于0.05，說明在此試驗條件下兩者之間的交互作用不顯著。AB的P值小于0.05，說明兩者的交互作用顯著。為了更直觀地反映酶添加量、pH交互作用對淀粉純度的影響，繪制出相應的等高線圖和三維曲面圖。如圖1表示。

圖1 酶添加量與pH對淀粉純度影響的3D圖和等高線圖Fig.1 Responsesurfaceand contour plots for the interaction effectsof pH and enzym edosageon extraction purity of the starch

由方差分析表4和圖1可以看出酶添加量和pH值交互作用對淀粉純度影響顯著，從等高線圖可以看出等高線層次較多，且呈橢圓狀，說明交互作用明顯。當酶添加量在1.0%～1.5%，pH在3.0～3.5范圍內，兩者隨著彼此的增加而呈現出增效的作用。當pH在3.5～5.0時，酶添加量在1.5%～2.0%的范圍內，淀粉純度隨著兩個因素的增大有一定的下降趨勢，從而出現事倍功半的效果。

產生這種變化的原因可能是在低酶濃度的情況下，酶用量的增加，酶與底物接觸面積增大，而蛋白酶活性受pH值的影響，在適宜pH的條件下促進了酒糟中淀粉和蛋白質的分離以及蛋白質的分解，因而使得淀粉純度逐漸增加。而兩者數值的繼續增加使得當酶濃度達到過飽和時，酶與底物產生競爭，對蛋白酶產生一定的抑制作用，一部分酶分子沒有與底物接觸的機會，導致蛋白質酶解率降低，淀粉純度下降[19]。而pH的逐漸提高使得酶活性受到影響，破壞了酶的反應環境，兩者條件不利因素的持續惡化，造成了淀粉純度下降。

酶解溫度與兩者的交互作用不顯著，極有可能是在單因素試驗中選擇了合適的3個溫度梯度，在這個溫度梯度內，酶的活性都沒有受到失活或者抑制的影響。因此這與酶添加量和pH值無明顯的交互作用。假如溫度梯度選擇過大，極有可能出現極顯著相關的結果。因此并不代表酶解溫度與pH值和酶添加量無交互作用。因為溫度對于酶促反應以及酶的活性有重要的影響，反之若找到一個合適的溫度范圍，那么其影響也相對的減小。

由Design-Expert8.0軟件分析可知，最大響應值對應的因素條件為：酶添加量為1.99%，pH3.48，酶解溫度39.57℃，酒糟淀粉純度預測值為69.59%。

2.2.3驗證試驗

對響應面分析得到的最佳工藝參數進行驗證試驗，同時驗證回歸模型預測值的準確性。考慮的驗證試驗的可操作性，將最佳工藝條件修正為：酶添加量為2.0%，pH3.5，酶解溫度40℃。驗證試驗進行3次平行重復試驗，得到酒糟淀粉純度平均值為70.23%，該值落在預測值的95%預測區間[68.51，70.68]內，說明優化得到的淀粉提取工藝條件參數準確可靠，該回歸模型具有較好的預測效果。

2.3酒糟淀粉的微觀形態

對經過優化后提取出來的淀粉樣品進行掃描電鏡微觀結構觀察，如圖2。

圖2 酒糟淀粉的掃描電鏡圖（×2 000、×5 000）Fig.2 SEM im agesofspirit-based distillers’grainsstarch（×2 000，×5 000）

從放大2 000、5 000倍的掃描電鏡圖可以看出，提取的酒糟淀粉表面結構較為完整、表面附著了一定的雜質、無裂痕、整體結構呈現出橢球型。證明利用酸性蛋白酶進行酶法提取酒糟淀粉，未對淀粉顆粒造成不良的影響。酒糟中的淀粉來自于高粱等禾谷類物質，比如高粱、小麥、玉米、大米等。這類物質的顆粒形態基本形狀為球形、橢球型等[20]。

對于釀酒工藝來說，反復的蒸煮糊化，以及入窖發酵，這對于淀粉顆粒的影響都是巨大的，而本試驗得到的酒糟淀粉呈現出與原始淀粉接近的形態，這可能是取樣的問題，本試驗酒糟取的是出窖底層酒糟，這層酒糟經過蒸煮糊化、低溫入窖的次數較少。而站在整個窖池不同層次的角度來看，越接近上層的酒糟，面糟、紅糟、丟糟中的淀粉顆粒形態可能會發生巨大的變化。其微觀形態可能與原糧的顆粒形態不同。但是從提取方法的視角來看，酶法對其微觀形態的影響較小。這與蘆鑫[8]和姜紹通[21]等的研究結論一致。

2.4酒糟淀粉的晶體結構

對經過優化后提取出來的淀粉樣品進行晶體結構觀察，如圖3。

圖3酒糟淀粉的X射線衍射圖Fig.3 X-ray diffraction patternsof spirit-based distillers’grains starch

圖3 為酒糟淀粉的X射線衍射圖，根據尋峰報告得出表5。

根據X衍射圖譜的差異，可將淀粉的晶型結構分為A、B、C和V 4種晶型。谷物淀粉大多數為A型[22]，提取的酒糟淀粉的晶型為A+V型，與原始高粱淀粉的A型不同。產生這種變化的原因有兩種可能，其一是酶法提取方法的因素，造成了淀粉晶型的改變。其二是酒糟淀粉特殊性造成。由于釀酒工藝的特殊性，使得酒糟淀粉晶型的改變。因為釀酒過程的反復蒸煮以及降溫無異于是通過物理或化學的方法處理淀粉，這極有可能使淀粉結構發生變化從而得到具有A+V型衍射圖樣的淀粉。其原因在于淀粉糊化后與脂類物質及有關化合物所形成的復合物的圖譜為V型，而這種圖譜在天然的淀粉中是不存在的[23]。鑒于此，產生的原因更加傾向于第二種可能。表示酶法提取酒糟淀粉對淀粉晶體結構并未產生顯著的影響。

表5 X射線衍射結果分析Table5 X-Ray diffraction analysis results

3結論

通過對堿法、酶法、SDS法對酒糟淀粉進行提取，以淀粉純度為主要參考依據，得出酶法對酒糟淀粉的提取效果較好。然后通過響應面試驗優化酶法提取的主要影響參數，從而獲得了酶法提取酒糟淀粉的最佳工藝參數：即酶添加量為2.0%，pH3.5，酶解溫度40℃。該條件下得到酒糟淀粉純度平均值為70.23%，建立的回歸模型具有較好的預測效果。

制得的酒糟淀粉顆粒細小、較為細滑，從掃描電鏡圖顯示該方法對淀粉顆粒未造成不良影響。從結晶性質來看，淀粉的晶型從原糧A型變為了A+V型，這極有可能與釀酒工藝的特殊性有關，而與提取方法無關，因此可以得出酶法并未對淀粉晶型造成不良的影響。酶法提取酒糟中的淀粉是可行的。

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Extraction Conditions of Starch from Spirit-based Distillers'Grains of Luzhou-flavor Liquor

DIAOChong1，LILi1，WANGXiang-yu2，GUOYu-liu3，YOUQi4，ZONGXu-yan1，*
（1.Sichuan University ofScience&Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China；2.Novozymes（China）InvestmentCo.，Ltd.，Beijing100085，China；3.HeilongjiangUniversity，Harbin 150080，Heilongjiang，China；4.Sichuan Langjiu Group Co.，Ltd.，Luzhou 646523，Sichuan，China）

The effects of the alkaline，enzyme，SDS extraction methods on the purity of starch from Spiritbased distillers'grains of Luzhou-flavor liquor.The results showed that，the highest purity of distillers'grains starch was enzyme extractionmethods.Based on single factor experiments，according to the principles of Box-Behnken centralcomposite design，three factorsand three levels response surfacemethod wasemployed to optimize the distillers'grains extraction conditions.The results revealed that the optimum enzymatic extraction pa rametersofdistillers'grainsstarchwereas following：enzyme dosage2%，pH 3.5，enzymatic temperature 40℃. Under this condition，the purity of distillers'grains starch was 70.23%.The physicochemical indexes of prepared distillers'grainsstarchwere revealed that：scanning electronmicroscopy figure revealed that the extractionmethod caused no damage to starch granule.Compared with native starch，the original A-type structure of native starch changed to（A+V）-type structure of distillers'grains.Perhaps it is not related to the extraction methodsbut theproduction techniquesof Luzhou-flavor liquor.

distillers'grains of Luzhou-flavor liquor；starch；extraction；response surface methodology；physicochemicalproperty

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.014

2016-11-02

固態釀造關鍵技術研究四川省院士（專家）工作站開放基金項目（GY2014-01）；釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室開放基金項目（NJ2014-07）；瀘州老窖科研獎學金項目（13ljzk6）

刁沖（1990—），男（漢），碩士研究生，研究方向：發酵工程。

*通信作者：宗緒巖（1976—），男，副教授，博士，主要從事食品生物化學、酶學應用及發酵過程控制的研究。