分心木多酚提取工藝及其抗氧化活性研究

陳冠林，劉學文，韓門娣，駱春霞，陳松根，*

（1.佛山市職業病防治所，廣東佛山528000；2.廣東省生物工程研究所，廣東廣州510316）

分心木多酚提取工藝及其抗氧化活性研究

陳冠林1，劉學文2，韓門娣1，駱春霞1，陳松根1，*

（1.佛山市職業病防治所，廣東佛山528000；2.廣東省生物工程研究所，廣東廣州510316）

以分心木為材料，輔助超聲波技術提取多酚研究，結合單因素和正交試驗，確定多酚提取的最佳工藝組合為料液比1∶40（g/mL），乙醇濃度30%，超聲15min，提取溫度為50℃。用FRAP、DPPH和ABTS3種方法測定了分心木多酚的抗氧化能力并用Folin-Ciocalteu法測定其總酚含量。結果表明分心木多酚在抗氧化能力和總酚含量方面是很好的抗氧化劑來源。

分心木；多酚；抗氧化性

分心木（Diaphragma juglandis Fructus），別名胡桃衣、胡桃夾、胡桃隔、核桃芯，為胡桃科胡桃屬植物胡桃（Juglans regia L.）。中醫認為，本品性味苦、澀、平，入脾、腎經，有健脾固腎、利尿清熱，治淋病尿血、暑熱瀉痢等功效，適用于治療遺溺、崩中下血、耳聾、治遺精、尿頻、帶下等[1]。我國的核桃資源非常豐富，2010年我國核桃年產量為128萬t，面積和產量均為世界第一[2]，分心木的產量也極其豐富。長期以來，我們只關注核桃仁的開發和利用，而對分心木的關注甚少，雖然一些學者對分心木進行了相關的研究[1，3-6]，但對分心木多酚提取條件的優化研究較少，而對分心木多酚的抗氧化性也缺少系統的研究，為了充分利用分心木資源以及減少能源、溶劑等生產成本的消耗，本文對分心木多酚提取條件進行優化，采用超高效液相（UPLC）測定其成分含量，并系統地研究其抗氧化活性，為進一步開發利用該資源提供依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

分心木：購于廣東省佛山市某市場。分心木干燥后用粉碎機粉碎，過20目篩，超聲波輔助乙醇浸提備用。

1.1.2試驗試劑

乙腈（色譜純）：德國Merck公司；乙醇（色譜純）：上海安譜科學儀器有限公司；Trolox（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，水溶性維生素E）、ABTS（2，2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，2，2'-聯氨-雙-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）、福林-酚試劑（Folin-Ciocalteu reagent）：購自美國Sigma公司；TPTZ（2，4，6-tris-2，4，6-tripiridyl-2-triazine，三吡啶三吖嗪）、DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）：購自阿拉丁公司；FeCl3、HCl、乙酸鈉、過硫酸鉀、沒食子酸、乙醇，均為分析純，由天津化學試劑廠生產。

1.2儀器與設備

UV-9600紫外/可見分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司；LEO-150S超聲清洗儀：昆山力波超聲波設備有限公司；ACQUITY UPLCH-CLASS超高效液相色譜儀：美國Waters公司；HD-100高速多功能粉碎機：諸暨市海道機械有限公司；SY2000旋轉蒸發器、SHZ-Ⅲ型循環水真空泵：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1單因素試驗

依據溶劑浸提理論，確定影響提取條件的主要因素有乙醇濃度、料液比、提取溫度以及提取時間，通過測定提取液中的分心木多酚的質量分數來確定各因素的最佳提取條件。

1.3.2正交試驗

在單因素試驗的基礎上，針對各因素的影響規律，利用四因素三水平進行正交試驗，對影響多酚提取效果的各因素進行優化。

1.3.3總酚含量的測定

取0.10mL待測樣品，加入2.50mLFolin-Ciocalteu試劑中，反應4min后，加入2.00mL 75 g/L的Na2CO3溶液，置室溫下反應120min，于760 nm下測定吸光度。結果以沒食子酸當量（gallic acid equivalents，GAE）表示，單位為mgGAE/g[7-8]。

1.3.4 UPLC色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCHSST3（50mm×2.1mm，1.8μm）；柱溫：30℃；進樣量：1μL；流速：0.3mL/min；流動相：乙腈-甲酸水溶液（0.2%甲酸），梯度洗脫（洗脫程序：0min，7%乙腈；4min，16%乙腈；6min，40%乙腈；7min，7%乙腈；10min，7%乙腈）[9]，結果以μg/g DW（dryweight）表示。

1.3.5 FRAP法測定抗氧化活性

FRAP試劑由10mmol/L的TPTZ（溶于40mmol/L鹽酸）、20mmol/L的三氯化鐵、300mmol/L的乙酸鈉緩沖液（pH3.6）以1∶1∶10（體積比）的比例混合而成。取100μL待測樣品，加入3mLFRAP溶液中充分混合，反應120min后于593 nm處測定吸光度。以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用μmol Trolox/g表示[10-11]。

1.3.6 DPPH法測定抗氧化活性

取0.1mL待測樣品，加入0.06mmol/LDPPH 80%乙醇溶液3.9mL，振蕩15 s，放置暗處反應2 h后，于515 nm處測定吸光度，按以下公式計算清除率：

以3.9mLDPPH+0.1mL 80%乙醇作對照，空白為80%乙醇，以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用Trolox當量表示，單位為μmolTrolox/g[12]。

1.3.7 ABTS法測定抗氧化能力

將7mmol/L的ABTS（用pH為4.5、20mmol/L的乙酸鈉配制）和2.45mmol/L的過硫酸鉀等體積混合，室溫下避光反應12 h～16 h，形成ABTS+·儲備液。使用前用20mmol/L乙酸鈉（pH4.5）將ABTS+·儲備液稀釋成為工作液，使其在734 nm處吸光度為0.700±0.005。取100μL待測樣品，加入3mLABTS+·工作液，室溫下反應2 h后，在734 nm處測定吸光度。以20mmol/L乙酸鈉（pH4.5）為空白，ABTS+·為對照，以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化樣品的抗氧化活性用TEAC（trolox equivalentantioxidant capacity）表示[10]，單位為μmol Trolox/g。

2結果與分析

2.1料液比

料液比對分心木多酚提取效率的影響見圖1。

圖1 料液比對分心木多酚提取效率的影響Fig.1 Effectof the ratio ofmaterial to extraction solventon extraction of phenolic contentsobtained from Diaphragma juglandis Fructus

由圖1可知，隨著溶劑用量的增加，分心木多酚的提取含量有所增加，但溶劑用量達到一定程度時，再增加溶劑用量不僅不能增加提取量，反而會增加生產成本。因此確定料液比為1∶30（g/mL）。

2.2乙醇濃度

不同濃度的乙醇對分心木多酚提取效率的影響見圖2。

圖2 不同濃度的乙醇對分心木多酚提取效率的影響Fig.2 Effectof ethanolconcentration on extraction rateof phenolic contentsobtained from Diaphragma juglandis Fructus

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，提取含量增加，乙醇濃度在40%時提取效率最高，當乙醇濃度再增加時提取效率降低，乙醇量的增大也會增加生產成本。因此確定乙醇濃度為40%。

2.3提取時間

提取時間對分心木多酚提取效率的影響見圖3。

圖3 提取時間對分心木多酚提取效率的影響Fig.3 Effectof extraction tim eon extraction rateof phenolic contentsobtained from Diaphragma juglandis Fructus

從圖3可以看出，隨著時間的延長提取效率有所增加，但10min后提取效率反而下降，提取時間過短則提取不完全，提取時間過長則耗時。因此確定10min為最佳的提取時間。

2.4提取溫度

提取溫度對分心木多酚提取效率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對分心木多酚提取效率的影響Fig.4 Effectof temperatureon extraction rateof phenolic contents obtained from Diaphragma juglandis Fructus

從圖4可以看出，隨著溫度的升高提取效率有所增加，但45℃后提取效率反而下降，提取溫度過低則提取不完全，提取溫度過高則耗能。因此確定45℃為最佳的提取溫度。

2.5分心木多酚提取的正交試驗分析

利用分心木多酚水解過程的單因素結果，確定料液比、乙醇濃度、超聲時間和提取溫度為4個主要的影響因素，并選定每個因素最佳范圍的3個水平（表1），然后設計L9（34）正交試驗，試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Tab le1 Factorsand levels in theorthogonalarray design

表2 正交試驗結果Table2 Orthogonalarray designm atrix and experimental results

從表2可知，影響分心木中多酚物質提取效果的因素排列順序為：A＞D＞C＞B，即料液比＞提取溫度＞超聲時間＞乙醇濃度，說明料液比對多酚的提取效果影響最大，其次是提取溫度，再次是超聲時間，而乙醇濃度對多酚的提取效果影響最小。4個因素的最佳組合方案時A3B1C3D3，即料液比1∶40（g/mL），乙醇濃度30%，超聲15min，提取溫度為50℃。經驗證試驗得，在該條件下從1 g分心木中可提取得多酚物質為56.46mgGAE。

2.6 UPLC分析結果

分心木多酚是分心木中含有多個苯環并且結合多個羥基的化學物質的總稱，主要包括酚酸類和黃酮類兩大部分，其色譜圖見圖5。

圖5 對照品（A）和分心木（B）的高效液相色譜圖Fig.5 UPLC chromatogram of standard（A）and Diaphragma juglandis Fructus（B）

由UPLC法測得的每克分心木中多酚的質量分數結果見表3。

表3 分心木多酚含量Table3 M ain phenolic com poundsand their contentsof Diaphragma juglandis Fructus

由表3可知，在現有的標準中，分心木中蘆丁的含量最高，其含量為1 168.78μg/g DW；其次是異鼠李素，其含量為713.85μg/g DW；丁香酸和對香豆酸的含量較低，分別為124.63、124.77μg/g DW。研究發現，純的酚酸和黃酮類化合物可以抑制銅誘導的低密度脂蛋白膽固醇的氧化，在眾多的羥基酸中，咖啡酸對低密度脂蛋白膽固醇氧化的抑制效果最好而對香豆酸和阿魏酸的抑制效果較差[13-16]。然而，其他的研究發現對香豆酸，沒食子酸，咖啡酸，兒茶素，表兒茶素等對低密度脂蛋白膽固醇的氧化有很好的抑制作用[13，16-17]，且混合酚類對低密度脂蛋白膽固醇氧化的抑制作用更好[18]。酚類化合物對低密度脂蛋白膽固醇氧化的抑制作用可能是酚類對自由基的清除或者與金屬離子螯合有關[19]。對除此以外，兒茶素和表兒茶素對N-二硝基亞硝胺和N-亞硝基哌啶誘導DNA損傷的肝癌細胞有保護作用[20]。

2.7抗氧化活性試驗

清除活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的研究中，DPPH，FRAP以及ABTS法是研究提取物抗氧化能力常用的方法。因此，本文采用FRAP、DPPH和ABTS法測定核桃殼多酚的抗氧化性，結果見圖6。

圖6 多酚物質的抗氧化活性研究Fig.6 Antioxidant capacitiesof phenolic contents

由圖6可知，FRAP、DPPH和ABTS法測得核桃殼多酚的抗氧化性分別為214.62、248.86和260.98μmol Trolox/g，表明分心木多酚的FRAP、DPPH·和ABTS+·抗氧化活性都比較強。Chen[21]等對33中水果抗氧化能力進行了研究，結果發現三華李的抗氧化能力最強，其對Fe3+還原能力為15.57μmol Trolox/g，對ABTS+·的清除能力為12.61μmol Trolox/g，但低于分心木多酚的抗氧化能力。與水果[22]、野生花[23]、蔬菜[24]以及谷類[25]等抗氧化能力相比較，分析木多酚的抗氧化能力均高于上述物質，但其抗氧化活性低于芍藥花以及桂花[9]。在對ABTS+·的清除能力研究中，分心木多酚的抗氧化活性低于龍眼核[26]、瞿麥等[27]中藥。研究發現，總酚含量與其抗氧化能力相關，總酚含量高，則其抗氧化能力強，酚類對預防氧化應激相關疾病有重要的作用[9]。原兒茶酸與ABTS以及DPPH的相關性較強；對香豆酸與ABTS以及FRAP的相關性較強；咖啡酸與FRAP的相關性較強；兒茶素與ABTS、DPPH以及FRAP的相關性較強；表兒茶素則與FRAP的相關性較強；槲皮素與ABTS、DPPH以及FRAP的相關性較強[9]。

3結論

通過單因素和正交試驗得出了分心木多酚提取的優化工藝條件為：料液比1∶40（g/mL），乙醇濃度30%，超聲15min，提取溫度為50℃。通過FRAP、DPPH以及ABTS 3種抗氧化活性方法測定分心木多酚的抗氧化能力，結果顯示分心木多酚是很好的抗氧化劑來源。

[1]楊明珠,田新雁,肖朝江,等.核桃分心木化學成分與生物活性研究[J].天然產物研究與開發,2012(12):1707-1711

[2]周曄,王偉,王成章,等.核桃屬(Juglans)植物多酚類物質研究進展[J].南京林業大學學報(自然科學版),2013(5):146-152

[3]畢肯·阿不得克里木,韓艷春,阿依吐倫·斯馬義.核桃分心木化學成分的預試驗研究[J].新疆醫科大學學報,2010(9):1044-1046

[4]王艷梅,高莉,劉夢,等.核桃隔膜化學成分定性研究[J].食品工業科技,2008(12):123-124

[5]高莉,王艷梅,帕提古麗·馬合木提.核桃分心木粗提物抑菌活性的研究[J].食品科學,2008(11):69-71

[6]高莉,王強,帕提古力·瑪合木提.核桃隔膜多糖的分離純化及單糖組成分析[J].食品科學,2010(21):182-185

[7]SINGLETON V L,ROSSIJA.Colorimetry of Total Phenolicswith Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagents[J].American Journalof Enology and Viticulture,1965,16(3):144-158

[8]SONG FL,GANR Y,ZHANG Y,etal.Total phenolic contentsand antioxidant capacitiesof selected chinesemedicinal plants[J].Int J MolSci,2010,11(6):2362-2372

[9]CHENG,CHEN S,XIE Y,et al.Total phenolic,flavonoid and antioxidantactivity of 23 edible flowers subjected to in vitro digestion [J].Journalof Functional Foods,2015,17:243-259

[10]OZGEN M,REESE R N,TULIO A Z,et al.Modified 2,2-Azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid(ABTS)Method to Measure AntioxidantCapacity of Selected Small Fruitsand Comparison to Ferric Reducing Antioxidant Power(FRAP)and 2,2‘-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)Methods[J].Journalof Agriculturaland Food Chemistry,2006,54(4):1151-1157

[11]BENZIE IFF,STRAIN JJ.The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP)asaMeasure of“AntioxidantPower”:The FRAPAssay[J]. AnalyticalBiochemistry,1996,239(1):70-76

[12]CAIY,SUN M,CORKE H.Antioxidant activity of betalains from plants of the amaranthaceae[J].JAgric Food Chem,2003,51(8): 2288-2294

[13]MEYER A S,HEINONENM,FRANKELEN.Antioxidant interactions of catechin,cyanidin,caffeic acid,quercetin,and ellagic acid on human LDLoxidation[J].Food Chemistry,1998,61(1/2):71-75

[14]CIRICOTL,OMAYEST.Additiveorsynergetic effectsofphenolic compoundson human low density lipoprotein oxidation[J].Food and Chemical Toxicology,2006,44(4):510-516

[15]MEYER A S,HEINONENM,FRANKELEN.Antioxidant interactions of catechin,cyanidin,caffeic acid,quercetin,and ellagic acid on human LDLoxidation[J].Food Chemistry,1998,61(1/2):71-75

[16]DECAMARGO A C,REGITANO-D ARCEM A B,BIASOTOA C T,etal.Low MolecularWeightPhenolicsofGrape Juiceand Winemaking Byproducts:Antioxidant Activitiesand Inhibition of Oxidation of Human Low-Density Lipoprotein Cholesterol and DNA Strand Breakage[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014,62(50):12159-12171

[17]AYOUB M,DE CAMARGO A C,SHAHIDI F.Antioxidants and bioactivities of free,esterified and insoluble-bound phenolics from berryseedmeals[J].Food Chemistry,2016,197:221-232

[18]NARDINIM,D'AQUINOM,TOMASSIG,etal.Inhibition ofhuman low-density lipoprotein oxidation by caffeic acid and other hydrox－ycinnamic acid derivatives[J].Free Radical Biology and Medicine, 1995,19(5):541-552

[19]CHANDRASEKARA A,SHAHIDIF.Bioactivities and Antiradical PropertiesofMilletGrainsand Hulls[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(17):9563-9571

[20]DELGADOM E,HAZA A I,GARCíA A,etal.Myricetin,quercetin, (+)-catechin and(-)-epicatechin protectagainstN-nitrosaminesinduced DNA damage in human hepatoma cells[J].Toxicology in Vitro,2009,23(7):1292-1297

[21]CHEN G,CHEN S,ZHAO Y,et al.Total phenolic contents of 33 fruitsand their antioxidantcapacitiesbefore and after in vitro digestion[J].IndustrialCropsand Products,2014,57:150-157

[22]FU L,XU B,XU X,et al.Antioxidant capacities and total phenolic contentsof62 fruits[J].Food Chemistry,2011,129(2):345-350

[23]LIA,LIS,LIH,etal.Total phenolic contents and antioxidant capacitiesof51edibleandwild flowers[J].Journalof Functional Foods, 2014,6:319-330

[24]DENGG,LIN X,XU X,etal.Antioxidantcapacitiesand total phenolic contentsof56 vegetables[J].Journalof Functional Foods,2013, 5(1):260-266

[25]DENGG,XUX,GUOY,etal.Determination of antioxidantproperty and their lipophilic and hydrophilic phenolic contents in cereal grains[J].Journalof Functional Foods,2012,4(4):906-914

[26]CHENG,CHEN S,CHEN F,etal.Nutraceutical potential and antioxidantbenefits of selected fruit seeds subjected to an in vitro digestion[J].Journalof Functional Foods,2016,20:317-331

[27]LIS,LIS,GAN R,et al.Antioxidant capacities and total phenolic contentsof infusions from 223medicinal plants[J].IndustrialCrops and Products,2013,51:289-298

Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Phenolic Contents in Diaphragma juglandis Fructus

CHENGuan-lin1，LIUXue-wen2，HANMen-di1，LUOChun-xia1，CHEN Song-gen1，*
（1.Foshan Institute ofOccupationalDisease Prevention and Control，Foshan 528000，Guangdong，China；2.Guangdong Provincial Bioengineering Institute，Gaungzhou 510316，Guangdong，China）

This paper reported the use of single-factor and orthogonalarray designmethods to optimize the integrated ultrasonicassisted extraction ofphenolic contents in Diaphragma juglandis Fructus.The optimal technological conditions for extracting phenolic contents in Diaphragma juglandis Fructuswere as follows：the ratio of material to solventwas1∶40（g/mL），ethanol concentrationwas30%，extraction timewas15min，and extraction temperaturewas50℃.FRAP，DPPH and ABTSmethodswere used to determine the antioxidantactivities of phenolic contents in Semen juglandis，and Folin-Ciocaheumethod was used to determine the total phenolic contents.Results indicated that phenolic contents in Diaphragma juglandis Fructuswere significant sources of antioxidants in termsof theirantioxidantactivitiesand totalphenolic contents．

Diaphragma juglandis Fructus；totalphenolic contents；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.015

2016-06-12

廣東省醫學科學技術研究基金項目（A2015617）

陳冠林（1984—），男（漢），醫師，碩士，研究方向：職業衛生、營養與食品衛生。

*通信作者：陳松根（1965—），男，主任醫師。