HPLC法測定乳飲料中紐甜含量的研究

郭躍平，石夢迪，徐廣偉，韋何雯，董曉尉

（金華市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江金華321000）

HPLC法測定乳飲料中紐甜含量的研究

郭躍平，石夢迪，徐廣偉，韋何雯，董曉尉

（金華市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江金華321000）

建立快速、準確測定乳飲料中紐甜含量的高效液相色譜檢測方法。樣品以20%乙腈水溶液為提取液，硫酸鋅和亞鐵氰化鉀為沉淀劑進行前處理，采用ZORBAXSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，200 nm檢測波長，磷酸氫二銨（0.020mol/L，pH 3.5～4）：乙腈=（70∶30）為流動相進行等度洗脫分離。紐甜在0.2μg/m L～50.0μg/mL范圍內線性良好，在0.8mg/kg～5.0mg/kg加標范圍內，回收率為90.1%～96.1%，RSD值為1.7%～2.1%，最低定量限為0.30mg/kg。

高效液相色譜法；乳飲料；紐甜

紐甜是一種新型功能性甜味劑，系阿斯巴甜的衍生物[1]，甜度約為蔗糖的8 000倍～13 000倍[2]，蔗糖的40倍以上，是一種強力甜味劑，甜味純正，甜味協和，穩定性好，價格低廉，紐甜作為甜味調節劑廣泛應用于乳飲料、糕點、調味品等各類食品中。研究表明，過量食用甜味劑會對人體健康造成危害，因此國家食品添加劑使用標準也對其作出了嚴格規定[3]。

當前食品中紐甜的檢測方法主要有高效液相色譜法、高液液相色譜串聯質譜聯用法等分析方法[4-5]。目前國標方法[6]通過提取、固相萃取等前處理過程對樣品進行凈化，再利用高效液相色譜進行梯度洗脫，能夠獲得較好的分離度，但由于過程復雜、操作繁瑣，并且儀器分析時間長，不利于日常檢測。乳飲料中含有較多的蛋白質等大分子成分，如前處理過程去除不充分，不但會影響色譜分離度，而且極易堵塞色譜柱，縮短色譜柱的壽命。本試驗參考相關研究[7-10]，在樣品前處理過程中加入硫酸鋅和亞鐵氰化鉀作為沉淀劑，有效地去除了樣品中蛋白等雜質，并建立了一種采用等度洗脫的高效液相色譜法測定乳飲料中的紐甜含量，該法操作簡單、快速、重復性好、回收率高。

1材料與方法

1.1樣品

從超市中購買不同廠家的乳飲料樣品，共計樣品數量20份。

1.2主要試劑

紐甜標準品（質量分數≥98.0%）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：購自上海安譜科學儀器有限公司；磷酸氫二銨（分析純）、硫酸鋅（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）：購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3主要儀器與設備

1200高效液相色譜儀：美國Agilent公司；KH-600DB型超聲波清洗器：昆山禾創超聲儀器有限公司；Direct-Q5UV超純水機：美國密理博公司。

1.4方法

1.4.1色譜條件

檢測波長：200 nm；色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18（250mm×4.6mm，5μm）；流速：1.0mL/min；進樣量：50μL；柱溫：30℃；流動相為A（0.020mol/L磷酸氫二銨，pH 3.5～4）：B（乙腈）=（70∶30）。

1.4.2樣品前處理方法

稱取10 g乳飲料樣品（精確至0.001 g）于100mL容量瓶中，加入5mL硫酸鋅溶液（240 g/L）和5mL亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L），再加入20%乙腈水溶液并定容至刻度，充分混勻，振蕩3min，放入超聲波清洗器中超聲40min，后經濾紙過濾，濾液再經0.45μm濾膜過濾，供高效液相色譜檢測。

2結果與分析

2.1色譜條件的優化

2.1.1檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器（DAD）對紐甜標準品溶液在波長190 nm～400 nm范圍內進行掃描，結果顯示，紐甜在的最大吸收值在195 nm～205 nm之間，因此本研究選擇200 nm作為檢測波長，紐甜光譜掃描圖見圖1。

圖1 紐甜紫外可見分光光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of neotame

2.1.2流動相及洗脫條件的選擇

本文對不同的流動相體系進行了研究，乙腈-離子對試劑緩沖液（辛烷磺酸鈉）、甲醇-乙酸銨（0.020mol/L）、乙腈-磷酸氫二鈉（0.020mol/L）、乙腈-磷酸氫二銨（0.020mol/L），結果表明乙腈-磷酸氫二銨（0.020mol/L）具有較好的分離效果，能滿足檢測要求。

將乙腈與磷酸氫二銨（0.020mol/L）在不同體積比的條件下對紐甜標準品進行等度洗脫（檢測波長200nm，柱溫箱30℃），紐甜在各自體系中的保留時間見表1。

表1 流動相中乙腈與磷酸氫二銨不同比例下的紐甜保留時間Table1 Retention timeof neotame in them obilephasew ith different proportion of acetonitrileand diammonium hydrogen phosphate

從表1可以看出，乙腈與磷酸氫二銨（0.020mol/L）的體積比為10∶90時，紐甜標準品在80min內都未出峰，體積比為20∶80時，紐甜的出峰時間為43.3min，效率比較低，當體積比為30∶70、35∶65和40∶60時，出峰時間分別為10.4、6.8、4.6min。出峰時間過快，易造成分離度不好，影響紐甜的出峰，因此選擇乙腈與磷酸氫二銨（0.020mol/L）的體積比為30∶70。

2.1.3色譜條件的確定

通過試驗，確定色譜條件：檢測波長200 nm，進樣體積50μL，柱溫30℃，流動相為乙腈與磷酸氫二銨（0.020mol/L）（體積比為30∶70），流速1mL/min。在此色譜條件下，紐甜標準品的色譜圖如圖2。

圖2 紐甜標準溶液色譜圖Fig.2 Chrom atogram of neotame standard solution

2.2樣品前處理方法的優化

2.2.1沉淀劑的選擇

由于所檢測的樣品為乳飲料，樣品中含有較多的蛋白質及其添加了穩定劑，如果樣品處理過程中不加入沉淀劑，那么供液相測定的濾液中含有較多的雜質，嚴重影響分離效果，以及會縮短色譜柱使用壽命，因此比較了硫酸鋅、亞鐵氰化鉀以及同時加入硫酸鋅和亞鐵氰化鐵作為沉淀劑去除雜質的效果。試驗表明，同時加入硫酸鋅和亞鐵氰化鉀，沉淀效果較好，而且沒有干擾峰，最終確定硫酸鋅和亞鐵氰化鉀作為沉淀劑。

2.2.2提取液的選擇及提取液中不同組分比例的確定

本研究對純水、30%甲醇水溶液、30%乙腈水溶液作為提取液進行了比較，試驗表明，純水作為提取液回收率不高，而30%甲醇水溶液和30%乙腈水溶液作為提取液均具有較高的回收率，這可能是因為紐甜更易溶于甲醇和乙腈，同時甲醇和乙腈可作沉淀劑，能更好地去除樣品中的雜質，由于乙腈是流動相，把乙腈水溶液作為提取液，能獲得更好的色譜分離度，因此選擇乙腈水溶液作為提取液。

分別將10%乙腈水溶液、20%乙腈水溶液、30%乙腈水溶液、40%乙腈水溶液、50%乙腈水溶液作為提取液進行比較，試驗表明20%～50%乙腈水溶液具有很高的回收率，10%乙腈水溶液回收率略低，從環境友好的角度考慮，最終選擇20%乙腈水溶液作為提取液。

2.3線性回歸方程、線性范圍和定量限

準確稱取紐甜標準物質，用20%乙腈水溶液配制成6種濃度的標準溶液，6種濃度分別為0.2、0.5、1.0、10.0、20.0、50.0μg/mL，按1.4.1中色譜條件進行分析，以質量濃度作為橫坐標，以峰面積作為縱坐標繪制標準曲線。以陰性樣品中加入目標化合物，采用1.4.2的前處理方法，1.4.1中色譜條件分析，以10倍信噪比（S/ N=10）確定定量限。紐甜的線性范圍、回歸方程、相關系數以及定量限如表2所示。

表2 線性范圍、回歸方程和定量限Table2 Regression equation，linear rangesand detection lim its

2.4檢測方法回收率和精密度

在陰性樣品中加入一定量的紐甜標準溶液，利用1.4.2的方法進行前處理，利用1.4.1的色譜分析條件進行儀器分析，考察方法的回收率和精密度，對不同的加標量進行平行試驗，每組做6個平行。試驗顯示，加標范圍在0.80mg/kg～5.0mg/kg之間，紐甜的回收率為90.1%～96.1%，RSD值為1.7%～2.1%，結果如表3所示。

表3 方法回收率和精密度（n=6）Tab le3 Recovery and p recision（n=6）

2.5實際樣品檢測結果

采用該方法對市售的20份乳飲料產品進行檢測，結果表明，有3份樣品有紐甜檢出，其中一份陽性樣品的色譜圖見圖3。

圖3 陽性樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of positive sample

3結論

本文建立了測定乳飲料中紐甜含量的高效液相色譜法。選擇磷酸氫二銨（0.020mol/L，pH 3.5～4）：乙腈=（70∶30）為流動相，200 nm為波長，獲得了較好的分離度和響應值，樣品前處理過程中，以硫酸鋅和亞鐵氰化鉀為沉淀劑，以20%乙腈水溶液為提取液，雜質去除效果好，并且回收率高。同時，該方法前處理簡單快捷、精密度好、準確度高，克服了國標方法過程復雜、操作繁瑣和回收率不穩定的劣勢，適合大批量樣品的測定，具有較強的實用價值。

[1]張金峰,沈寒晰,張存社,等.甜味劑紐甜合成新工藝[J].食品研究與開發,2011,32(4):73-75

[2]張金峰,沈寒晰,張存社.新型甜味劑紐甜研究進展[J].應用化工, 2010,39(10):1574-1577

[3]中國國家標準化管理委員會.GB2760-2014食品安全國家標準食品添加劑使用標準[S].北京:中國標準出版社,2014:16-18

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Determ ination of Neotame in M ilk Drinks by H igh Perform ance Liquid Chrom atography

GUOYue-ping，SHIMeng-di，XUGuang-wei，WEIHe-wen，DONGXiao-wei
（Institute for Food and Drug Controlof Jinhua City，Jinhua 321000，Zhejiang，China）

Toestablish an analysismethod for the determination ofneotame inmilk drinksby High Performance Liquid Chromatography（HPLC）.Sampleswereextracted by 20%acetonitrilewatersolution asextraction solution，zinc sulfate and potassium ferrocyanide asprecipitating agent，and the purified solutionswere analyzed by HPLC with a ZORBAX SB-C18 column（250 mm×4.6 mm，5μm）using diammonium hydrogen phosphate（0.02mol/L，pH 3.5-4）-acetonitrilesolution（70∶30）as themobile phase in equaldegree program，thedetectionwavelengthwas200 nm.The standard curvesofneotame in the rangeof0.2μg/mL-50.0μg/mL showed good linearity.The average recoveriesofneotamewas90.1%-96.1%in range of0.8mg/kg-5.0mg/kg addition，and the relative standard deviationwas1.7%-2.1%.The limitsofquantitation forneotamewas0.30mg/kg.

HPLC；milk drinks；neotame

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.039

2016-06-14

郭躍平（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品質量與安全。