發酵工藝條件對黑曲霉產黃曲霉毒素B1降解酶的影響

雷嬌，宋宏新，李鵬娟，薛海燕，肖瑜，徐丹，*

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021；2.寶雞市食品藥品檢驗檢測中心，陜西寶雞721013）

發酵工藝條件對黑曲霉產黃曲霉毒素B1降解酶的影響

雷嬌1，宋宏新1，李鵬娟1，薛海燕1，肖瑜2，徐丹1，*

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021；2.寶雞市食品藥品檢驗檢測中心，陜西寶雞721013）

為研究黑曲霉產黃曲霉毒素B1（AFB1）降解酶的影響因素，試驗以AFB1降解率作為評價指標，考察不同培養基成分和不同發酵條件對黑曲霉產AFB1降解酶的影響。結果顯示，碳源、氮源、金屬離子、AFB1類似物等對黑曲霉生長影響不大，但對降解酶合成有顯著影響，且該酶是一種誘導酶；發酵溫度、時間、初始pH等對降解酶合成也有顯著影響，當發酵溫度為30℃時AFB1降解率達87.5%，初始pH為7.0時AFB1降解率達89.3%，發酵時間與AFB1降解率呈正相關性，培養4 d時降解率達83.5%。研究結果可為AFB1降解酶的發酵工藝條件優化及工業化生產提供理論指導。

黑曲霉；黃曲霉毒素B1；降解；發酵工藝

黃曲霉毒素B1（AFB1）是由黃曲霉產生的具有強致癌性的次級代謝產物，1993年被世界衛生組織（WHO）定為Ι類致癌物[1-3]。其在糧食作物中的污染最為嚴重，2011年～2012年，由于奶牛飼料被AFB1污染，使得我國蒙牛、南山等乳制品中AFM1超標，不僅危害公眾健康，同時給企業及社會造成巨大的經濟損失，成為影響社會穩定的食品安全事件。因此，控制食品中真菌毒素的污染成為一個亟待解決問題。

傳統的物理和化學方法在一定程度上能降低AFB1的污染[4-6]，但通常這兩種方法都存在去毒不完全、易降低食品的營養價值、應用性差等缺點[7-8]。因此，尋找一種安全、高效脫除AFB1的方法就顯得尤為重要，而微生物降解AFB1具備上述優勢，其代表了真菌毒素防治的新方向[9-10]。Alberts[11-12]發現紅串紅球菌發酵液對AFB1有降解效果，孵育48h后，降解率達83%，且與AFB1相比，降解產物的致突變性明顯減弱；Guan[13]研究發現嗜麥芽窄食單胞菌發酵液經蛋白酶K、SDS和加熱處理后，降解效果明顯下降，其最適酶解溫度為37℃、pH為8，且Mg2+、Cu2+對AFB1降解有激活作用，Zn2+則有抑制作用。

國內學者李冰等[14]從黑曲霉中提取了對AFB1有降解效果的胞外粗提液，其降解率達93.28%；本試驗室前期研究發現從醬醅中分離出的黑曲霉具有降解AFB1的作用，且該作用屬于胞外酶的酶促降解，為探究發酵條件對黑曲霉產黃曲霉毒素B1降解酶的影響，本試驗在前期試驗基礎上以AFB1降解率及菌體干重作為評價指標，研究培養基成分及發酵條件對黑曲霉產AFB1降解酶的影響，為后期大規模發酵試驗提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

黑曲霉（Aspergillusniger），分離于醬醅中，PDA培養基4℃保存。

1.1.2培養基

馬鈴薯固體培養基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，自然pH，121℃高壓滅菌20min。

馬鈴薯液體培養基（PDB）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L、自然pH、121℃高壓滅菌20min。

1.1.3試劑

AFB1標準品：Sigma公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：Fisher公司；三氯甲烷（分析純）、正己烷（分析純）、三氟乙酸（化學純）：阿拉丁試劑有限公司。

1.1.4儀器與設備

SW-CJ-1D型潔凈工作臺：蘇州凈化設備廠；MJ-180B型霉菌培養箱：上海躍進醫療器械廠；Agilent1200高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；LDZM-40KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；HZQ-F160恒溫震蕩培養箱：常州諾基儀器有限公司；MD 200氮吹儀：杭州奧盛儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1黑曲霉孢子懸浮液的制備

將黑曲霉菌種接種于PDA斜面培養基中，30℃培養7 d，用生理鹽水洗脫并收集孢子，調整濃度為105CFU/mL，備用。

1.2.2培養基成分對黑曲霉產AFB1降解酶的影響

1.2.2.1碳源

將PDB中葡萄糖分別用蔗糖、麥芽糖，乳糖代替，添加量為2%，向含有不同碳源的培養基中接種黑曲霉孢子懸浮液（培養基為50mL，接種量為2%），30℃、150 r/min培養72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測定菌體干重及AFB1的降解率，分析碳源對黑曲霉產AFB1降解酶的影響。

1.2.2.2氮源

向PDB中分別添加硝酸鈉、氯化銨、酵母膏和蛋白胨，添加量為0.2%，并向含有不同氮源的培養基中接種黑曲霉孢子懸浮液（培養基為50 mL，接種量為2%），30℃、150 r/min培養72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測定菌體干重及AFB1的降解率，分析氮源對黑曲霉產AFB1降解酶的影響。

1.2.2.3金屬離子

向PDB中分別添加Fe3+，Ca2+，Mn2+，Zn2+，添加量為5mmol/L，并向含有不同金屬離子的培養基中接種黑曲霉孢子懸浮液（培養基為50mL，接種量為2%），30℃、150 r/min培養72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測定菌體干重及AFB1的降解率，分析金屬離子對黑曲霉產AFB1降解酶的影響。

1.2.2.4結構類似物

向PDB中分別添加香豆酸和香豆素，添加量為0.05%，并向含有不同結構類似物的培養基中接種黑曲霉孢子懸浮液（培養基為50mL，接種量為2%），30℃、150 r/min培養72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測定菌體干重及AFB1的降解率，分析結構類似物對黑曲霉產AFB1降解酶的影響。

1.2.3發酵條件對黑曲霉產AFB1降解酶的影響

1.2.3.1溫度

將黑曲霉孢子懸浮液接種于50mLPDB（接種量為2%），分別于20、25、30、35、40℃，150 r/min培養72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測定菌體干重及AFB1的降解率，分析溫度對黑曲霉產AFB1降解酶的影響。

1.2.3.2 pH值

調節PDB初始pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，并向不同初始pH的培養基中接種黑曲霉孢子懸浮液（培養基為50mL，接種量為2%），30℃，150 r/min培養72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測定菌體干重及AFB1的降解率，分析pH對黑曲霉產AFB1降解酶的影響。

1.2.3.3培養時間

將黑曲霉孢子懸浮液接種于50mLPDB（接種量為2%），30℃，150 r/min，分別培養1、2、3、4、5、6、7 d后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測定菌體干重及AFB1的降解率，分析發酵時間對黑曲霉產AFB1降解酶的影響。

1.2.4測定方法

菌體干重測定先用紗布過濾菌絲體，用無菌水將收集到的菌絲體沖洗兩次，80℃下烘干至恒重。降解率的測定采用柱前衍生HPLC-FLD檢測方法測定樣品中毒素的含量，計算降解率。

2結果與討論

2.1培養基成分對黑曲霉產AFB1降解酶的影響

2.1.1碳源

菌體生長和代謝產物的積累均需要一定的碳源，尤其是以產酶為目的的發酵過程中，一些碳源物質成分對促進產酶有重要的影響。碳源對菌體干重的影響如圖1所示，碳源對黑曲霉產AFB1降解酶的影響如圖2所示。

圖1 碳源對菌體干重的影響Fig.1 Effectofcarbon sourceson thedryweightof Aspergillusniger

圖2 碳源對黑曲霉產AFB1降解酶的影響Fig.2 Effectof carbon sourceson degradation enzymeof AFB1produced by Aspergillusniger

由圖1、圖2可知不同碳源對黑曲霉生長無顯著影響（P＞0.05），但對AFB1降解酶的合成影響顯著（P＜0.05），其中添加蔗糖的效果最好，毒素降解率達91.5%，可能因為黑曲霉分泌的β-呋喃果糖苷酶能分解蔗糖產生葡萄糖和果糖，而果糖更容易被黑曲霉利用產酶[15]。

2.1.2氮源

氮源是微生物細胞生長和代謝的主要營養物質，其功能是為生物細胞合成含氮代謝產物，也是構成酶的主要成分[16]。氮源對菌體干重的影響如圖3所示，氮源對黑曲霉產AFB1降解酶的影響如圖4所示。

由圖3～圖4所示，只有酵母膏能促進黑曲霉生長，而當額外添加氮源時能將AFB1降解率從61%提高到73.5%，黑曲霉對氯化銨和酵母膏的利用率較高，且酵母膏中含有的必需氨基酸及B族維生素、核苷酸、微量元素等促進了黑曲霉的新陳代謝和產酶，使得它比其他氮源表現出更好的促進效果。

圖3 氮源對菌體干重的影響Fig.3 Effectof nitrogen sourceon the dryweightof Aspergillus niger

圖4 氮源對黑曲霉產AFB1降解酶的影響Fig.4 Effectofnitrogen sourceson degradation enzymeof AFB1produced by Aspergillusniger

2.1.3金屬離子

金屬離子對菌體干重的影響如圖5所示，金屬離子對黑曲霉產AFB1降解酶的影響如圖6所示。

圖5 金屬離子對菌體干重的影響Fig.5 Effectofmetal ionson the dryweightof Aspergillusniger

圖6 金屬離子對黑曲霉產AFB1降解酶的影響Fig.6 Effectofmetal ionson degradation enzym eof AFB1produced by Aspergillusniger

如圖5～圖6所示，Fe3+能顯著抑制黑曲霉生長，進而降低AFB1降解酶的產量，孫啟紅[17]等研究發現高濃度Fe3+對細菌的生長有明顯的抑制作用，推測Fe3+對細菌的抑制作用是通過Fe3+催化羥自由基的形成抑制細菌生長；Zn2+、Ca2+、Mn2+對黑曲霉生長影響不大，但Zn2+、Ca2+對降解酶合成有明顯促進作用，將AFB1降解率分別提高至76%、93%，可能由于Zn2+、Ca2+與AFB1降解酶結合，從而提高了酶活。

2.1.4結構類似物

結構類似物對菌體干重的影響如圖7所示，結構類似物對黑曲霉產AFB1降解酶的影響如圖8所示。

圖7 結構類似物對菌體干重的影響Fig.7 Effectof AFB1analogueson thed ry weightof Aspergillusniger

如圖7～圖8所示，香豆素和香豆酸對黑曲霉生長的促進作用較小，但能顯著增強降解酶的合成，尤其添加香豆酸的黑曲霉發酵液降解效果好，降解率達到89.5%，說明該降解酶很可能是一種誘導酶，AFB1的結構類似物作為誘導物誘導酶的合成。

圖8 結構類似物對黑曲霉產AFB1降解酶的影響Fig.8 Effectof AFB1analogueson degradation enzymeof AFB1produced by Aspergillusniger

2.2發酵條件對黑曲霉產AFB1降解酶的影響

2.2.1發酵溫度

溫度對黑曲霉產AFB1降解酶的影響如圖9所示。

圖9 溫度對黑曲霉產AFB1降解酶的影響Fig.9 Effectof tem peratureon degradation enzymeof AFB1produced by Aspergillusniger

如圖9所示，在20℃～30℃之間，溫度的增加有助于黑曲霉對AFB1的降解，在30℃時毒素降解率達到最大值87.5%，當溫度大于40℃后，黑曲霉產AFB1降解酶的能力明顯下降，這說明溫度對黑曲霉生長有較大的影響，黑曲霉所產酶系的最適溫度一般都在30℃左右，如黑曲霉液態發酵生產果膠酶時，當發酵溫度控制在30℃時酶活達到最大值[18]。

2.2.2初始pH值

初始pH對黑曲霉產AFB1降解酶的影響如圖10所示。

如圖10所示，pH在4～7之間時，黑曲霉對AFB1的降解率逐漸增加，在pH 7.0時降解率達到最高值89.3%，當pH大于7后，降解效果逐漸減弱，說明pH值在4～7時有利于黑曲霉生長產酶，從而促進了對AFB1的降解作用。

圖10 初始pH對黑曲霉產AFB1降解酶的影響Fig.10 Effectof initialpH on degradation enzym eof AFB1produced by Aspergillusniger

2.2.3培養時間

時間對黑曲霉產AFB1降解酶的影響如圖11所示。

圖11 時間對黑曲霉產AFB1降解酶的影響Fig.11 Effectof tim eon degradation enzymeof AFB1produced by Aspergillusniger

如圖11所示，隨著時間的延長黑曲霉發酵液降解毒素的能力逐漸增強，在培養第3天到第4天時黑曲霉降解率有顯著增加，從57%增加到83.5%，隨著培養時間的增加，黑曲霉解毒酶對AFB1的降解率趨于穩定，說明培養到第6天時黑曲霉所產AFB1降解酶達到穩定。

3結論

碳源、氮源、金屬離子、AFB1類似物等對黑曲霉生長影響不大，但對降解酶合成有顯著影響，且該酶是一種誘導酶；發酵溫度、時間、初始pH等對降解酶合成也有顯著影響。而微生物在發酵過程中受到的影響因素眾多，代謝產物的調控及其復雜，為進一步優化AFB1降解酶的發酵工藝條件，提高發酵產物的產量，還要考慮各因素之間的交叉影響，并利用數學模型預測和優化各影響因素，指導工業化大生產。

[1]Do JH,Choi D K.Aflatoxins:Detection,Toxicity,and Biosynthesis [J].Biotechnologyand Bioprocess Engineering,2007,12(6):585-593

[2]Sheikh A S,Ahmad A,Mohd SH,et al.The Potential Hazards of Aspergillus sp.in Foods and Feeds,and the Role of Biological Treatment A Review[J].Journal ofMicrobiology,2014,52(10):807-818

[3]IARC.Some naturally occurring substances:food items and constituents,heterocyclic aromatic amines and mycotoxins[J].IARC monographson theevaluation of carcinogenic risks tohumans,1993, 56:489-521

[4]Grace D,Mahuku G,Hoffmann V,etal.Internationalagricultural research to reduce food risks:casestudieson aflatoxins[J].Food Security,2015,7(3):569-582

[5]Turcotte A M,Scott PM,Tague B.Analysis of cocoa products for ochratoxin A and aflatoxins[J].Mycotoxin Research,2013,29(3): 193-201

[6]關舒,胡新旭,馬秋剛,等.黃曲霉毒素的傳統去毒方法和生物降解研究進展[J].飼料工業,2008,29(24):57-59

[7]肖軍霞,張巖,黃國清,等.黃曲霉毒素脫除方法研究進展[J].食品安全質量檢測學報,2012,3(5):395-399

[8]Xu D,Wang H,Zhang Y,et al.Inhibition of non-toxigenic Aspergillus niger FS10 isolated from Chinese fermented soybean on growth and aflatoxin B1production by Aspergillus flavus[J].Food Control,2013,32(2):359-365

[9]Gao X,Ma Q,Zhao L,etal.Isolation of Bacillus subtilis:screening for aflatoxins B1,M1,and G1 detoxification[J].European Food Research and Technology,2011,232(6):957-962

[10]Farzaneh M,Shi ZQ,Ghassempour A,et al.Aflatoxin B1degradation by BacillussubtilisUTBSP1 isolated from pistachionutsof Iran [J].Food Control,2012,23(1):100-106

[11]Alberts JF,Engelbrecht Y,Steyn PS,etal.Biological degradation ofaflatoxin B1by Rhodococcus erythropolis cultures[J].International Journalof Food Microbiology,2006,109(1/2):121-126

[12]Teniola OD,Addo PA,Brost IM,etal.Degradation ofaflatoxin B1by cell-free extracts of Rhodococcuserythropolis and Mycobacterium fluoranthenivoranssp.nov.DSM44556(T)[J].International Journalof Food Microbiology,2005,105(2):111-117

[13]Guan S,JiC,Zhou T,etal.Aflatoxin B1degradation by Stenotrophomonas maltophilia and other microbes selected using coumarin medium[J].International Journal ofMolecular Sciences,2008,9(8): 1489-1503

[14]李冰,董征英,常維山.黑曲霉對黃曲霉毒素B1的降解與應用研究[J].試驗研究,2012(11):6-10

[15]Dorta C,Cruz R,Olivaneto PD,et al.Sugarcanemolassesand yeast powder used in the Fructooligosaccharides production by Aspergillus japonicus-FCL 119T and Aspergillus niger ATCC 20611 [J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2006,33 (12):1003-1009

[16]曾慶華,陳利梅,李德茂.黑曲霉液體發酵產α-半乳糖苷酶發酵條件優化[J].安徽農業科學,2010,38(1):339-341

[17]Sun H Z,HangW C,Lu X,etal.Siderophore production from 27 filamentous fungal strainsand a novel siderophorewith potential biocontrol applications from Aspergillusniger An76[J].Journal of Life Science,2008,3(1):19-26

[18]衛春會,楊輝.黑曲霉液態發酵生產果膠酶的工藝條件初探[J].食品研究與開發,2005,26(2):62-64

Effects of Fermentation Conditions on the Production of A flatoxin B1Degradation Enzyme from Aspergillus niger

LEIJiao1，SONGHong-xin1，LIPeng-juan1，XUEHai-yan1，XIAOYu2，XUDan1，*
（1.Schoolof Food and BiologicalEngineering，ShaanxiUniversity ofScienceand Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China；2.BaojiTesting Centerof Food and Drug Inspection，Baoji721013，Shaanxi，China）

To study the effectof different factors on the production of aflatoxin B1（AFB1）degradation enzyme from Aspergillus niger.Experiment with AFB1degradation rate as the evaluation index，inspected different culturemedium and different fermentation conditions.The results showed that the carbon and nitrogen sources，metal ionsand AFB1analogshad little effecton the growth of Aspergillusniger，buthad significanteffecton the synthesisofdegradation enzyme，and the enzymewasan inducible enzyme.Furthermore，fermentation temperature，time and initial pH had significanteffects on the degradation ofenzyme synthesis.When the temperature（30℃）and the initial pH 7，the degradation rate of AFB1reached 87.5%and 89.3%，respectively.The re－search also found that fermentation time and the degradation rate of AFB1waspositively correlated.On the days 4，degradation rate of AFB1was83.5%.The research results can provide theoreticalguidance for the optimization of fermentation conditionsand industrialproduction of AFB1degradingenzyme.

Aspergillusniger；aflatoxin B1；degradation；fermentation condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.041

2016-12-09

陜西省科技廳自然基金項目（2013JQ3019）；陜西省農業科技創新與攻關項目（2015NY002）

雷嬌（1991—），女（漢），在讀研究生，研究方向：食品安全與質量控制。

*通信作者：徐丹（1981—），女，講師，博士，研究方向：食品營養與安全。